Systèmes de défense contre le radical hydroxyle HO•

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

Production, Propriétés et Cibles des ERO

Un schéma récapitulatif de la production, de la réactivité et des cibles des ERO dans les cellules eucaryotes et procaryotes est représenté à la fin de cette partie (Figure 4).

Le superoxyde O2•–

Production de O2•–

L’oxygène est utilisé comme accepteur final d’électrons pour la respiration, au niveau de la membrane interne pour les procaryotes et de la mitochondrie pour les eucaryotes (Figure 2).

Dans les deux cas, eucaryote et procaryote, le bilan de la respiration cellulaire correspond à la réduction à quatre électrons de l’oxygène conduisant à la formation d’une molécule d’eau et d’une molécule d’ATP(Metzler 2001). Cependant, certaines molécules de dioxygène peuvent être réduites à un seul électron,principalement au niveau de la NADH ubiquinone réductase de la chaîne mitochondriale (complexe I). Ceci aboutit à la formation du radical superoxyde (O2•– ) qui, par la suite, peut se dismuter spontanément en peroxyde d’hydrogène (H2O2) et être à l’origine de la formation du radical hydroxyle (HO• ) (Imlay 2003; Gutteridge and Halliwell 2000).

Davies 2000). Ainsi la respiration pour les cellules eucaryotes et procaryotes est la source principale de formation de O2•– . Cependant, O2•– peut également être produit au niveau cytosolique notamment par la xanthine oxydase et par autooxydation des flavines réductases, des glutathion réductases et de certains xénobiotiques (Imlay 2008; Massey 2000). Chez les eucaryotes, la source la plus importante de O2•– après la respiration mitochondriale est la NADPH oxydase localisée dans les cellules phagocytaires (DeCoursey and Ligeti 2005). Ces cellules constituent un maillon important de l’immunité innée. En effet, la présence de microorganismes pathogènes dans les organismes eucaryotes active la NADPH oxydase dans la membrane du phagosome qui produit alors un flux important de O2•– . Celui-ci se dismute pour former H2O2 qui, par l’action de la myéloperoxydase produit de l’acide hypochloreux (HOCl) responsable de l’élimination des microorganismes pathogènes dans la cellule (Hampton et al. 1998). C’est ce que l’on appelle le « burst oxidatif », qui est un processus vital pour la défense des cellules contre les microorganismes pathogènes (Winterbourn 2008).

Réactivité de O•–

Bien que O2•– soit une espèce radicalaire et qu’il soit d’un point de vue thermodynamique à la fois oxydant et réducteur (E (O2•– / H2O2) = + 940 mV/ENH et E (O2 / O2•– ) = – 160 mV/ENH), il reste peu réactif vis-à-vis des molécules biologiques et sa diffusion est très limitée(Sawyer and Valentine 1981). Une de ses principales carcatéristiques est de se dismuter très rapidement pour former H2O2 selon l’équation (1). 2O2•─ + 2H+ H2O2 + O2 (1)

O2•– et les centres Fe-S

Dans les années 90, il a été cependant mis en évidence qu’il existait des cibles spécifiques du O•– dans les cellules, notamment certaines enzymes à centres [Fe-S]. Il a été montré que O•– inactive spécifiquement les deshydratases en oxydant leur centre [Fe-S] (Figure 3) (Imlay 2006; Flint et al. 1993). Cela concerne par exemple les aconitases et les dihydroacides deshydratases impliquées dans la biosynthèse des acides aminés branchés (Boehme et al. 1976). Cette oxydation entraîne la destruction partielle du centre [Fe-S] et la libération dans la cellule d’atomes de fer sous forme Fe2+ (Figure 3).

Bien que la détérioration du centre [4Fe-4S] entraîne une inactivation de ces enzymes, •– il a été montré que l’effet toxique de O résulte surtout de la libération de fer dans la cellule, sous une forme dite libre. Ces derniers catalysent la réaction de Fenton qui conduit à la • formation du radical HO très réactif(Imlay 2006 ; Keyer and Imlay 1996). Les deshydratases actuellement l’origine majeure de la toxicité de O •– chez les eucaryotes et les procaryotes. 2 O2•– et NO O2•– peut également réagir avec le monoxyde d’azote (NO) produit dans les cellules eucaryotes par l’activité des NO synthases (NOS) pour former l’anion peroxynitrique (ONOO-). L’anion peroxynitrique est un agent oxydant et nitrant très puissant. Il peut réagir avec le dioxyde de carbone pour former du carbonate (CO32– ) et un radical dioxide nitrique (NO2• ) qui oxyde l’ADN et les protéines (Winterbourn 2008).

L’oxydation des protéines par l’anion peroxynitrique aboutit à la nitration des résidus aromatiques et soufrés. La nitration des tyrosines peut empêcher la phosphorylation de celles-ci et perturbe certaines voies de transduction du signal (Radi et al. 2001). La formation de ONOO– peut avoir pour consequences des cassures de brin d’ADN par oxydation ou nitration des bases en formant par exemple des 8-oxo ou 8-nitroguanines (Radi et al. 2001).

Le peroxyde d’hydrogène (H2O2)

Production et réactivité de HO

H O est principalement formé par la dismutation de O•– (équation 1). Il est aussi produit dans les peroxysomes par des oxydases comme la lactate oxydase ou la glucose oxydase dont l’activité libère de grandes quantitésd’H 2O2 (Imlay 2008).

H2O2 est très oxydant mais reste relativement peu réactif dans la cellule. Il peut traverser librement les membranes biologiques et donc agir assez loin de son lieu de formation (Imlay 2008).

Toxicité d’H O

En dehors du fait que H2O2 est un substrat de la myéloperoxydase dans les phagosomes, sa toxicité principale est liée à son mplication dans la réaction de Fenton (équation 2). HO peut être réduit par du fer ferreux en HO(Gutteridge and Halliwell 2000).

Comme cela a été décrit précédemment, ce fer libreput provenir de la dégradation des centres [Fe-S] des deshydratases par O2•– . Fe2+ + H2O2 HO• + HO- + Fe3+ (2)

Ferriques réductases

La réaction de Fenton peut être généralement considérée comme catalytique dans la cellule car le fer ferrique Fe peut être réduit en Fe grâce à la présence d’enzymes très actives dans la cellule, les ferriques réductases, qui utilisent le NAD(P)H comme donneur d’électrons (Woodmansee and Imlay 2002).

Le radical hydroxyle (HO•)

Production de HO•

HO• est le plus toxique des ERO. Dans la cellule, il se forme uniquement par la réaction de Fenton (équation 2), impliquant principalement le fer ferreux (Fe2+) libre mais aussi le cuivre (Cu+) disponible dans la cellule (Gutteridge and Halliwell 2000).

Notons qu’il est considéré que seules les formes dites libres du fer, par opposition aux formes associées aux métalloprotéines, peuvent catalyser la réaction de Fenton. Bien que la nature exacte de ces formes libres du fer reste encore peu définie, il n’en demeure pas moins qu’elles sont généralement décrites comme les formes du fer les plus dangereuses pour la cellule du fait de leur implication dans la réaction de Fenton (Pierre and Fontecave 1999).

Réactivité de HO•

Le radical HO• est extrèmement réactif et a une durée de vie trèslimitée (inférieure à la microseconde). Il réagit pratiquement au niveau de son lieu de production (Gutteridge and Halliwell 2000), selon trois modes d’action (Winterbourn 2008): – en arrachant un électron

– en arrachant un atome d’hydrogène : HO• + RH H2O + R•

Dans ce cas une nouvelle espèce radicalaire apparaît et peut être impliquée par exemple dans l’initiation des réactions en chaîne responsables de la peroxydation lipidique.

– en s’additionnant sur les doubles liaisons : HO• + >C=C< >•C-C(OH)-entraînant par exemple l’hydroxylation de bases pur iques et pyrimidiques de l’ADN et de certains acides aminés aromatiques.
Cibles de HO•

Les protéines

Les principales modifications de HO• sur les protéines sont des oxydations d’atomes de carbones. Au niveau de la chaîne principale des acides aminés, ces oxydations conduisent à des fragmentations ou à des pontages covalents inte rprotéiques. Au niveau des chaînes latérales, elles entraînent une perte de la fonction catalytique ou structurale de la protéine modifiée(Davies et al. 1987).

Les lipides

L’oxydation des acides gras membranaires par HO • , appelée processus de peroxydation lipidique, est un mécanisme de dégradation en chaîne conduisant à la formation d’hydroperoxyde (ROOH) instable. HO • est capable d’arracher un hydrogène sur les alcènes présents sur la chaîne carbonée des lipides. De cette peroxydation lipidique découle une diminution de la fluidité membranaire et donc une altération du fonctionnement des membranes cellulaires, des dépôts de lipides oxydésdans les vaisseaux ou les tissus âgés et de l’apparition de dérivés potentiellement carcinogènes tels que des diènes conjugués, des aldéhydes, ou encore des alcanes(Bruckdorfer 1998).

L’ADN

Les oxydations de l’ADN par HO • se font au niveau des sucres et des bases des nucléotides. Concernant les sucres, l’arrachement d’un hydrogène entraîne une coupure monobrin et la libération de la base correspondante. La structure double brin de l’ADN est alors fortement perturbée. Au niveau des bases, HO peut arracher un atome d’hydrogène ou s’additionner sur les doubles liaisons riches en électrons. Ceci ne crée pas de coupure de brin mais peu fortement perturber les processus de réplication, de transcription et de traduction.

Ces événements conduisent à des mutations qui, à terme, peuvent être responsables du vieillissement ou de la mort cellulaire (Henle and Linn 1997; Cadet et al. 1999).

L’oxygène singulet (1O2)

Le dioxygène se caractérise par un état électroniqudit triplet (3O2), avec la présence de deux électrons non appariés ayant le même étatde spin. C’est donc un diradical. L’oxygène singulet 1O2 correspond au dioxygène dans un état électroniquexcité où les deux électrons sont appariés(Pryor et al. 2006). 1O2 apparait au cours de réactions photochimiques, soit par l’action de la lumière visible soit par l’action de rayonnements ultraviolets lointain sur divers pigments biologiques comme les flavines. Ces pigments absorbent des photons, un état excité apparaît alors dans leur structure électronique, puis l’énergie libérée lors du retour à l’état fondamental est transférée à l’oxygène(Pryor et al. 2006). 1O2 est particulièrement réactif et diffuse très bien à travers les membranes. Il peut accepter un doublet d’électrons pour former des peroxydes. Il a pour cibles biologiques les membranes, l’ADN et les protéines sur lesquelles il induit des dommages similaires à ceux produits par HO • (Pryor et al. 2006).

1O2 peut également apparaître durant les cycles de peroxydation lipidique. Par exemple, les dommages cellulaires occasionés lors de l’exposition de la peau à la lumière visible, sont en partie dues à la production d’ 1O2 lors de la peroxydation lipidique, amplifiant ainsi les processus d’oxydation (Pryor et al. 2006).

Les systèmes de défense

L’adaptation des cellules à la présence d’oxygène dans l’atmosphère s’est faite par le développement de différents systèmes de détoxification des ERO. Ces systèmes peuvent être soit enzymatiques, soit non enzymatiques fonctionnant ainsi comme des piégeurs stœchiométriques d’ERO.

Systèmes moléculaires non enzymatiques

Chez les mammifères, il existe deux types de molécules antioxydantes dont l’efficacité est directement liée à leurs concentrations dans la cellule ainsi qu’à leurs capacités de régénération(Winterbourn 2008) :

-Les antioxydants d’origines cellulaires : les thiols, comme par exemple le glutathion, qui réduisent HO et HO• . 2 2 ••-et

-Les antioxydants d’origines alimentaires : l’ascorbate (vitamine C) qui réduit OH, O2 •• HO2 . Les tocophénols liposolubles, les caroténoïdes etles polyphénols qui réduisent OH, RO2 • et 1O2 et inhibent ainsi les réactions en chaîne de la peroxydation lipidique (Schafer et al. 2002; Pryor et al. 2006).

Afin de conserver un faible taux global d’ERO dans la cellule, ces molécules doivent être néanmoins assistées par des systèmes de détoxification enzymatiques.

Systèmes enzymatiques

Il existe plusieurs enzymes capables de réduire fortement la concentration de certains ERO dans la cellule. Ces systèmes enzymatiques sont spécifiques pour une espèce donnée. Ils concernent principalement l’élimination du radical superoxyde et des peroxydes.

Systèmes de défense contre O •–

Jusqu’au début des années 2000, le seul système enzymatique connu pour éliminer le superoxyde était la superoxyde dismutase (SOD) (Fridovich 1986). Cette enzyme catalyse très efficacement la réaction de dismutation du superoxyde en H2O2 et O2 avec une constante de vitesse proche de la vitesse de diffusion des molécules en solution (équation 3)(Fridovich 1986). Les SODs sont des métalloprotéines présentes cheztous les organismes aérobies, des bactéries aux organismes supérieurs(Fridovich 1997). Il existe quatre classes de SODs qui diffèrent selon la nature du métal lié au site actif (Afonso et al. 2007) :

– les SODs à fer, présentes uniquement dans les bactéries

– les SODs à manganèse, dans les mitochondries et les bactéries

– les SODs à cuivre/zinc, dans le cytoplasme, les c hloroplastes et les peroxysomes des eucaryotes

– les SODs à nickel, uniquement dans les bactéries

Les SODs à fer et manganèse ont une structure similaire mais n’ont pas d’homologie structurale avec les SOD à nickel et à cuivre/zinc, qui sont entre elles également différente.

Dans tout les cas, le métal se trouve à l’intérieurde la protéine et le O• ─ parvient au site actif grace à un canal composé d’acides aminés chargés permettant une attraction électrostatique vers le métal.

Le mécanisme catalytique des SODs est le même quelq soit la nature du métal. Il se décompose en deux demi-réactions, faisant interveni O2• ─ alternativement en tant qu’oxydant (équation 3a) et réducteur (équation 3b) vis-à-visdu métal (M).

Le rapport de stage ou le pfe est un document d’analyse, de synthèse et d’évaluation de votre apprentissage, c’est pour cela clepfe.com propose le téléchargement des modèles complet de projet de fin d’étude, rapport de stage, mémoire, pfe, thèse, pour connaître la méthodologie à avoir et savoir comment construire les parties d’un projet de fin d’étude.

Table des matières

Abréviations & Notations
Introduction
I. Oxygène, respiration et stress oxydant
I.1. Production, Propriétés et Cibles des ERO
I.1.1. Le superoxyde O2•–
I.1.2. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2)
I.1.3. Le radical hydroxyle (HO•)
I.1.4. L’oxygène singulet (1O2)
I.2. Les systèmes de défense
I.2.1. Systèmes moléculaires non enzymatiques
I.2.2. Systèmes enzymatiques
I.2.2.1. Systèmes de défense contre O2•–
I.2.2.2. Systèmes de défense contre H2O2
I.2.2.3. Systèmes de défense contre le radical hydroxyle HO•
I.3. Conséquences du stress oxydant
I.4. Rôle des ERO dans la signalisation cellulaire
I.5. Conclusion
II. La Superoxyde Réductase : SOR
II.1. Caractéristiques structurales de la SOR
II.1.1. Classe I
II.1.2. Classe II
II.1.3. Classe III
II.2. Mécanisme réactionnel de la SOR
II.2.1. Description du mécanisme réactionnel de la SOR
II.2.2. Nature du premier intermédiaire
II.2.3. Rôle de la lysine 48 dans la libération d’H2O2
II.2.4. Les complexes mimétiques
II.2.5. Comparaison de la SOR avec le Cytochrome P450
III. Rôle des liaisons hydrogène dans le site actif des protéines Fe-S
IV. Objectif de la thèse : Etude du rôle du ligand axial cystéine dans la réactivité de la SOR avec le superoxyde
Matériels & Méthodes
I. Matériels Biologiques
I.1. Souches bactériennes
I.2. Vecteur de surexpression
I.3. Milieu de culture
II. Méthodes de biologie moléculaire
II.1. Préparation d’ADN plasmidique
II.2. Digestion de l’ADN
II.3. Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose
II.4. Transformation dans l’ADN d’E. coli
II.4.1. Préparation des cellules compétentes
II.4.2. Transformation des cellules compétentes
II.5. Mutagénèse dirigée par PCR
III. Culture cellulaire
III.1. Surexpression des SOR sauvages et mutantes de Desulfoarculus baarsii
III.2. Complémentation de l’activité SOD
IV. Méthodes de biochimie
IV.1. Préparation des extraits solubles
IV.2. Purification des protéines
IV.2.1. Ancien protocole de purification
IV.2.2. Nouveau protocole de purification
IV.3. Détermination de l’état oligomérique de la protéine
IV.4. Analyse biochimique
IV.4.1. Electrophorèse de protéine : SDS-PAGE
IV.4.2. Dosages
IV.5. Etudes en fonction du pH
IV.5.1. Stabilité des SORs en fonction du pH
IV.5.2. Détermination du pKa des mutants
IV.6. Titration Redox
IV.7. Test d’activité
IV.8. Test turn over NADPH / Hypoxanthine / XO
V. Méthodes spectroscopiques
V.1. Spectroscopie UV-Visible
V.2. Spectroscopie Infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)
V.3. Spectroscopie de résonnance paramagnétique électronique : RPE
V.4. Spectrométrie de masse
V.5. Spectroscopie RAMAN de résonnance
Résultats & Discussions
INTRODUCTION
PARTIE 1 : Caractérisation des SORs mutantes I118A, I118D, I118S et I118V
I. Obtention des protéines mutantes
II. Spectrométrie de masse
III. Spectroscopie UV-visible
IV. RPE
V. Stabilité des mutants en fonction du pH et détermination des pKa de la transition alcaline
V.1. Stabilité en fonction du pH
V.2. Détermination du pKa de la transition alcaline
VI. Détermination des potentiels redox des mutants
VII. Conclusion
PARTIE 2 : Caractérisation spécifique de la SOR
I. Résonance Raman : Effets des mutations sur la force de la liaison S-Fe
II. Spectroscopie IRTF (infrarouge à transformée de Fourier)
III. Conclusion
PARTIE 3 : Radiolyse pulsée
I. Principe de la radiolyse pulsée
II. Rappel de l’étude du mécanisme réactionnel de la SOR wt
III. Effet des mutants sur k1
III.1. Reconstitution du spectre du T1
IV. Effet des mutants sur le k2
IV.1. Reconstitution du spectre du T2
V. Effet des mutants sur le k3
V.1. Spectre du produit final
VI. Conclusion
PARTIE 4 : Propriétés des espèces Fe-OOH des mutants I118
I. Etude par résonance Raman des espèces Fe-OOH
II. Etudes par spectrométrie de masse des espèces Fe-OOH
PARTIE 5 : Effet des mutations sur l’activité catalytique de la SOR
I. Test de cycles catalytiques multiples (multiples turn overs) sur les mutants I118
II. Test in vivo : complémentation de l’activité SOD
Conclusion Générale
Annexes
Annexe 1 : Mathé et al. Article JBC 2007
Bibliographie