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Application à la détection de petites molécules : L’adénosine comme modèle
Notion de petites molécules
Le terme petite molecule, dans son sens le plus large, fait référence à des composés de faible poids moléculaire, défini par opposition aux macromolécules (acides nucléiques, protéines, polysaccharides) dont la taille est en général 200 à 300 fois plus élevée. Cette notion demeure néanmoins ambigüe car la détermination de la limite supérieure, en termes de poids moléculaire, ne fait toujours pas consensus dans la littérature. Nous retrouvons ainsi des études évoquant des limites allant de 0,5 à 2 kDa [18, 29, 41, 43-53]. En pharmacologie, ce terme est restreint aux molécules possédant une forte affinité et capacité d’interaction avec les macromolécules. Leur poids moléculaire est alors limité à 0,5 kDa [54, 55]. Il correspond à la borne en dessous de laquelle les molécules peuvent diffuser à travers la membrane cellulaire [53-55]. Parmi les grandes catégories auxquelles appartiennent les petites molécules, il est possible de citer : les acides aminés, les carbohydrates, les ions inorganiques, les nucléotides et dérivés, les stéroïdes, les cofacteurs, les toxines, etc.
Du fait de leur propriété de diffusion à travers les membranes biologiques [53], les petites molécules se retrouvent impliquées dans diverses fonctions physiologiques.
Leur rôle peut donc s’avérer nocif comme dans le cas des toxines et des cancérigènes, ou bénéfique comme dans le cas des médicaments et des nutriments. Au sein des cellules, les petites molécules organiques servent en tant qu’agent de signalisation, de défense immunitaire ou encore de pigments [53, 56, 57]. En biologie moléculaire et en thérapeutique, elles sont utilisées sous forme d’antibiotiques ou médicaments. Il peut s’agir de composés naturels, tels que les métabolites secondaires, ou de composés synthétiques, tels que les molécules antivirales [53]. Leur application s’étend également au domaine environnemental, notamment en agriculture où elles sont utilisées comme pesticides [58].
La majorité des analyses dans le domaine biomédical, alimentaire, environnemental ou encore sécuritaire (défense nationale) impliquent la détection de molécules au poids moléculaire inférieur à 1 kDa [51]. Le développement de techniques de détection de petites molécules, on peut aisément le deviner, est donc d’un intérêt certain. Les autorités gouvernementales et réglementaires exigent par ailleurs l’utilisation de méthodes de détection simples, sensibles et intégrées dans des dispositifs portatifs dans le but de réaliser des analyses sur le terrain. Les méthodes de détection traditionnelles (chromatographies et spectroscopies de masse) s’avèrent peu adaptés pour ce type d’application [59]. Elles nécessitent en effet des temps de préparation d’échantillons relativement longs, une importante mobilisation de personnel – de préférence hautement qualifié – ainsi qu’une détection post-analyse et non en temps-réel.
Le format biocapteur, avec sa taille réduite et sa facilité de mise en œuvre offre une solution prometteuse pour ce type d’application. Historiquement, ce sont les enzymes et les anticorps qui ont été utilisés en premier en tant qu’éléments de reconnaissance pour la détection de petites molécules via un dispositif biocapteur [51, 60]. Pourtant, les aptamères se sont vite imposés comme une alternative sérieuse.
Les petites molécules et les aptamères
Bien qu’ils ne représentent que 17 % [29] de l’ensemble des aptamères sélectionnés à ce jour, les aptamères ciblant les petites molécules sont parmi les plus étudiés dans la littérature [29]. A titre d’exemple, en termes de nombre de publications produites sur les aptasensors, l’aptamère anti-ATP est classé second derrière celui de l’aptamère ciblant la protéine thrombine. Les aptamères anti- cocaïne et théophylline sont quant à eux classés cinquième et septième, respectivement.
Du fait de leur haute affinité et sélectivité, ils sont même considérés comme des éléments de reconnaissance idéaux pour la détection de petites molécules [28, 61]. La plus petite molécule organique cible utilisée pour la sélection d’aptamères est l’éthanolamine, une molécule formée de deux atomes de carbone liant deux groupements fonctionnels, hydroxyl et amine [62]. Cet aptamère a pu être sélectionné à partir d’une méthode dite FluMag-SELEX, basée sur marquage fluorescent de l’ADN et l’immobilisation de la molécule cible sur des billes magnétiques. L’interaction de cet aptamère avec sa cible implique par ailleurs une affinité importante, les Kd variant de 6 à 19 nM.
Si de nombreux exemples d’aptamères sélectionnés contre les petites molécules existent dans la littérature, nous nous contenterons de citer les catégories suivantes :
Les aptamères sélectionnés contre les colorants organiques
Dans le but de démontrer la validité du principe SELEX, Ellington et Szostak [6] ont choisi d’utiliser différents colorants organiques (Bleu Cibacron, Réactif Bleu, Réactif vert, etc.) comme molécules cibles, du fait de leur capacité à mimer les cofacteurs métaboliques. Ils ont ainsi décrit la sélection d’aptamères en série ARN et ADN spécifiques de 6 colorants différents. Les auteurs ont également montré que la fixation était spécifique du type de séquence utilisée, la version ARN de l’aptamère ADN sélectionné ne parvenant pas à fixer la molécule cible.
Les aptamères sélectionnés contre les ions inorganiques
Ciesiolka et al. ainsi que et Hofmann et al. ont décrit la sélection d’aptamères, en série ARN, possédant une bonne affinité pour le Zn2+ [63, 64] et pour le Ni2+ [65] respectivement. Sélectionnés par la méthode SELEX, ces aptamères présentent des constantes de dissociation comprises entre 1 μM et 1 mM.
Les aptamères sélectionnés contre des nucléotides et dérivés
Nous retrouvons également des exemples d’aptamères sélectionnés contre des nucléotides, nucléosides et dérivés. A titre d’exemple, le premier aptamère spécifique de l’ATP a été sélectionné par Sassanfar et Szostak en 1993 [66].
Un aptamère ARN tronqué de 40 nucléotides fixant l’ATP avec un Kd de 0,7 μM a ainsi été sélectionné. Huizenga et Szostak [67] ont par la suite pu obtenir un aptamère en série ADN fixant également l’ATP.
Les aptamères sélectionnés contre des cofacteurs
Lauhon et Szostak [68] ont, par exemple, décrit la sélection d’aptamères ARN fixant les cofacteurs flavine et nicotinamide. Il ainsi pu être démontré, pour la première fois, que des aptamères ADN et ARN de séquences identiques possédaient la capacité de fixer la même molécule cible (ici la flavine), avec néanmoins une affinité plus faible pour la série ADN. Concernant la sélection pour les nicotinamides, les résultants obtenus ont révélé que les aptamères ARN sélectionnés étaient capables de discriminer entre les deux états de réduction de la molécule nicotinamide adénine dinucléotide (NAD).
Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés à une petite molécule en particulier, l’adénosine.
L’adénosine et son aptamère
L’adénosine (9-β-D-ribofuranosyl-6-aminopurine) est un nucléoside purique formé d’une base adénine attachée à un noyau ribose via une liaison β-glycosidique (Figure 1.7). Présente dans toutes les cellules de l’organisme, elle est synthétisée de façon continue aussi bien dans le milieu intracellulaire qu’extracellulaire.
La production et le relarguage de l’adénosine sont habituellement augmentés lorsque les conditions environnementales deviennent hostiles. En effet, si l’on considère des conditions physiologiques normales, la concentration intracellulaire en adénosine est sous contrôle enzymatique et reste faible (~ 200 nM) [69, 70]. En cas de stress cellulaire, la synthèse se fait essentiellement par dégradation de l’adénosine tri-phosphate (APT) et la concentration en adénosine extracellulaire augmente, pouvant atteindre jusqu’à 100 fois les valeurs initiales [69, 70]. De plus, quand la concentration intracellulaire en ATP s’effondre, suite à l’utilisation excessive d’énergie, celle en adénosine croît considérablement. Cette adénosine est ensuite transportée dans l’espace extracellulaire via divers transporteurs [69].
Ainsi, en cas de stress métabolique, il existe une augmentation des concentrations en adénosine extracellulaire, constituant ainsi un marqueur sensible d’un état physiopathologique spécifique [71].
L’adénosine est impliquée dans une multitude de systèmes physiologiques incluant les systèmes nerveux, cardiovasculaire, gastro-intestinal, urogénital, respiratoire et lymphatique. Ses effets biologiques affectent donc plusieurs organes vitaux. Au niveau du système respiratoire, l’adénosine régule la contraction du muscle lisse bronchique, augmente la sécrétion de mucus et module l’activité d’un grand nombre de cellules immuno-inflammatoires associées avec certaines maladies pulmonaires inflammatoires [70, 72, 73]. D’autres effets biologiques importants se manifestent au niveau des vaisseaux (vasodilatation et vasoconstriction), des plaquettes (effet antiagrégant), du rein (inhibition de la libération de rénine), du cœur et du système nerveux autonome (réduction de l’activité des neurones sympathiques et parasympathiques). Dans le système nerveux central, l’adénosine induit un effet analgésique, anti-convulsant, neuroprotecteur, anxiolytique et inhibe l’activité motrice [70, 72, 73].
A ce titre, le développement de systèmes de détection de l’adénosine pourrait donc être utile au domaine biomédical, notamment à travers un dispositif de type aptasensor. L’adénosine constitue par ailleurs la molécule modèle par excellence dans le cadre de développement d’aptasensors ou l’étude fondamentale de l’interaction petite molécule/cible, faisant ainsi l’objet d’un très grand nombre de publications [29].
L’aptamère anti-adénosine a été sélectionné par Huizenga et Szostak [67] à partir d’une banque oligonucléotidique contenant 2 x 1014 molécules d’ADN simples brins.
La structure minimale fonctionnelle de cet aptamère est composée de 27 nucléotides. D’un point de vue structural, il est formé par deux tiges séparées par deux plateaux de guanine (quartet), constituant ainsi une poche pour l’interaction avec l’adénosine (Figure 1.8). La liaison de l’aptamère fait intervenir aussi bien la base que le sucre composant l’adénosine, au moyen notamment d’interactions électrostatiques [67]. La constante de dissociation du complexe a été estimée à 6 ± 3 µM [67, 74]. Par ailleurs, tel que mentionné précédemment, un premier aptamère de série ARN, sélectionné pour l’ATP, s’est également révélé en mesure d’interagir, avec une moindre affinité et spécificité, avec l’adénosine.
La détection d’adénosine au moyen d’aptasensors
De nombreuses stratégies ont été développées pour détecter la présence d’adénosine au moyen d’un biocapteur impliquant l’utilisation d’aptamères. A titre d’exemple, on peut citer celles basées sur la fluorescence [75], l’électrochimie [76] ou encore la colorimétrie [77]. Ces stratégies ont en commun l’exploitation du changement conformationnel de l’aptamère ainsi que l’utilisation d’un marqueur ou de nanoparticules d’or. Les limites de détection atteintes sont généralement dans la gamme micro et nanomolaire [29].
Un autre exemple qui mérite d’être développé est celui représentant l’une des premières applications pratiques pour la détection d’adénosine. Il fait intervenir un dispositif de type bandelette-test [78] (Figure 1.9).
Des agrégats de nanoparticules biotinylées et fonctionnalisées par des aptamères sont déposés sur une bandelette qui est ensuite séchée. L’immersion de l’extrémité de la bandelette dans une solution échantillon entraîne alors la réhydratation des agrégats. En l’absence de la cible, les agrégats ne peuvent migrer du fait de leur trop grande taille. En revanche, l’ajout de la cible entraîne la redispersion des nanoparticules, qui peuvent alors migrer à travers une membrane puis être capturées sur une fine ligne de streptavidine, entraînant l’apparition d’une coloration rouge. Parmi les autres stratégies développées, la détection optique de type résonance de plasmon de surface (SPR) a gagné une attention croissante ces dernières années [47, 79]. Elle est basée sur un principe de variation de l’indice de réfraction d’une surface sélective lors de l’interaction sonde/cible (Voir Chapitre 2). La SPR est pourtant connue comme étant limitée à la détection de molécules d’un poids moléculaire supérieur à 2 kDa [52, 80] (hors gamme petites molécules). La fixation des petites molécules, du fait de leur faible poids moléculaire, n’est pas en mesure d’entrainer une variation d’indice de réfraction significative.
Dans ce contexte, l’utilisation de la SPR comme technique de détection de petites molécules constitue un défi en soi.
Motivés par les avantages uniques qu’offre cette technique (fonctionnement en temps réel, absence de marquage, bonne sensibilité, mode d’opération non destructif, multiplexage), les scientifiques ont rivalisé d’imagination pour élaborer des stratégies visant à améliorer ses performances de détection pour les petites molécules (Voir Chapitre 3). Dans le cas de l’adénosine, la plus faible limite atteinte aujourd’hui est de l’ordre du picomolaire [81], valeur d’autant plus remarquable si l’on tient compte de son Kd (6 µM). Souhaitant participer à cette émulation scientifique, nous avons choisi de relever le défi en choisissant d’utiliser la SPR comme technique de détection de petites molécules au moyen d’un aptasensor.
Objectifs de la thèse
Nous nous proposons de développer un dispositif de type biocapteur à aptamères en vue d’une détection de petites molécules au moyen de la technique de résonance des plasmons de surface (SPR). Pour cela, notre modèle d’étude est l’adénosine, molécule de signalisation par excellence pour laquelle un intérêt existe dans le domaine biomédical. Les variations de ses concentrations physiologiques représentent en effet un marqueur d’états physiopathologiques spécifiques. Un aptamère anti-adénosine a par ailleurs été sélectionné dans les années 1996 et a fait l’objet de nombreuses applications de détection, notamment via des dispositifs de type biocapteurs (aptasensors).
Dans un premier temps, l’élaboration de la biopuce a exigé le recours à l’utilisation d’autres types d’aptamères, sélectionnés cette fois-ci contre la protéine thrombine pour laquelle une détection directe par SPR est possible. Notre attention sera focalisée sur l’utilisation de différents traitements de surface dans le but de réduire le taux de signal non spécifique et d’augmenter le rendement d’interaction sonde/cible. Une fois le protocole validé, la biopuce pourra alors être utilisée comme plateforme d’étude pour la détection d’adénosine.
Une première stratégie mettant en œuvre l’utilisation de nanoparticules d’or (AuNPs) et de séquences d’aptamères clivées (Split aptamers) a été imaginée en vue d’augmenter les performances de détection de petites molécules par SPR, reconnues dans la littérature comme étant limitées.
Une attention particulière sera préalablement apportée au protocole de fonctionnalisation des AuNPs en vue de concilier l’obtention d’un grand facteur d’amplification avec la réduction du signal non spécifique suite au phénomène d’interaction. En utilisant des séquences Split aptamers comportant un nombre de bases complémentaires différent (4 et 8), il sera possible d’étudier l’influence de ce paramètre sur la qualité de l’interaction de l’adénosine avec les sondes, notamment en termes de limite de détection et de stabilité thermodynamique.
En nous basant justement sur la stabilité thermodynamique mise en jeu lors de l’interaction des Split aptamers avec l’adénosine, une nouvelle stratégie de détection sera utilisée. Dans ce cas, le dispositif SPR est couplé à un système de régulation de température, permettant ainsi d’assurer la dissociation des complexes et d’établir des profils de dénaturation caractéristiques. Cela devrait permettre de différencier les profils impliquant ou non la présence de la cible dans la solution. Il sera par ailleurs possible d’envisager une caractérisation quantitative du phénomène d’interaction, notamment à travers l’extraction des paramètres thermodynamiques.
Ces différents aspects du projet permettront d’explorer les potentialités d’une plateforme de détection composée d’aptamères couplée à une détection SPRi pour la caractérisation multiplexée des interactions impliquant les petites molécules.
L’imagerie par résonance des plasmons de surface (SPRi)
Le phénomène de résonance plasmonique de surface
Le plasmon de surface correspond à l’oscillation collective d’électrons libres à l’interface entre deux milieux : un métal (Al, Ag, Au, Cu, …) et un diélectrique. La résultante de ces oscillations est une onde électromagnétique évanescente, appelée onde plasmon, se propageant à cette même interface sur une épaisseur spécifique (Figure 2.1). La fréquence de cette onde est dépendante de l’indice optique local du milieu diélectrique, c’est-à-dire de la quantité de matière présente à l’interface.
L’intérêt pour les plasmons de surface prit toute son importance à partir de 1968 suite aux travaux d’Otto [2] ainsi que ceux de Kretschmann et Reather [3] qui développèrent différentes configurations expérimentales pour exploiter ce phénomène. Les travaux de Nylader et Liedberg [4] marquent quant à eux un tournant majeur dans l’application des plasmons de surface. Pour la première fois, il réussirent à exploiter la configuration de Kretshmann pour détecter des molécules gazeuses ainsi que l’interaction anticorps (IgG)/ antigène (a-IgG) [4].
Figure 2.2 Résonance plasmonique de surface selon la configuration de Kretschmann. Une fine couche d’or de quelques dizaines de nanomètres d’épaisseur est directement en contact avec la base d’un prisme d’indice n. Un faisceau de lumière polarisée est alors dirigé, au travers de ce prisme, vers l’interface métal/diélectrique avec un angle d’incidence interne θ. Le champ évanescent s’étend dans le métal et se couple avec le plasmon de surface à l’interface entre le métal et l’air. Les changements de l’indice de réfraction dans le milieu diélectrique sont détectés jusqu’à 100-200 nm à partir de l’interface, en fonction de la qualité du revêtement d’or et la longueur d’onde de la lumière.
Afin de mieux comprendre le phénomène dont il est question, nous pouvons considérer en premier lieu un système composé d’une simple interface séparant deux milieux d’indice de réfraction (n1, n2), de sorte que n1 > n2. Il existera alors un angle d’incidence, noté θc, au-delà duquel l’intensité lumineuse envoyée sur l’interface sera totalement réfléchie : on parle alors de phénomène de réflexion totale. Ce phénomène s’accompagne de la formation d’une onde évanescente dans le milieu d’indice n2, qui s’attenue en s’éloignant de la surface. Considérons à présent un système optique, tel que proposé par Kretschmann [3], où les deux milieux sont séparés par une couche métallique de quelques dizaines de nanomètres (Figure 2.2). Dans ce cas, pour les angles d’incidence θ inférieurs à θc, l’intensité du faisceau lumineux réfléchi sera très importante, les métaux réfléchissant la lumière pour les longueurs d’onde appartenant au spectre visible. A l’inverse, pour θ > θc, du fait de l’excitation des plasmons, une forte atténuation de l’intensité réfléchie est observée. L’intensité passe par un minimum pour un angle caractéristique θr, l’angle de résonance. Cette excitation résulte d’un couplage entre la lumière incidente (photons) et les électrons de conduction du métal (Figure 2.1).
L’énergie lumineuse est alors absorbée par le métal, provoquant cette diminution caractéristique de l’intensité réfléchie. Au niveau de l’interface, comme précisé plus haut, le plasmon correspond à une oscillation de la densité de charges se propageant le long de l’interface [5]. Un champ électromagnétique est crée dans le milieu d’indice n2 (diélectrique), et présente les caractéristiques d’une onde évanescente, son amplitude décroissant exponentiellement avec la distance par rapport à la surface (Figure 2.1). Cette propriété fait du plasmon une sonde locale, sensible aux modifications des propriétés de l’interface métal/diélectrique, notamment les variations d’indice de réfraction. Plusieurs techniques ont ainsi tiré profit des propriétés des ondes évanescentes, parmi lesquelles la résonance des plasmons de surface (SPR).
En résumé, le plasmon de surface est une onde de densité de charges se propageant à l’interface séparant un métal et un diélectrique. Il peut être excité par une onde lumineuse, induisant une forte diminution de l’intensité réfléchie. Cette atténuation résulte du couplage entre la lumière incidente et les électrons de conduction du métal. Cette propriété étant sensible à l’indice du milieu diélectrique au niveau de l’interface, elle est à l’origine de l’utilisation de la SPR pour la détection des interactions moléculaires. Ainsi, lorsqu’une molécule s’adsorbe sur la couche d’or, elle modifie les propriétés des plasmons de surface, notamment la valeur de l’angle de résonance. Ceci implique une variation de l’indice du milieu qui sera d’autant plus importante que le nombre ou la taille des molécules seront grands. Il est ainsi possible de : 1) Quantifier la quantité de molécules adsorbées sur la surface, tel que démontré par Stenberg et al. [6] ; 2) Suivre en temps réel les cinétiques d’interactions.
Imagerie SPR
En général, les cinétiques d’interactions sont suivies en mesurant la variation de réflectivité en temps réel. A titre d’exemple, l’une des première mesures de l’hybridation de l’ADN par SPR remonte aux années 1990 [7]. La SPR a alors été utilisée pour mesurer l’intensité réfléchie par la surface d’or fonctionnalisée par une seule séquence (format monocapteur). Parmi les SPR monocapteurs commercialisés, le Biacore® est le plus fréquemment utilisé. Très vite cependant, l’idée d’un SPR multicapteur, de type imagerie SPR, permettant des mesures en parallèle a été proposée par l’équipe de Knoll [8]. Ainsi, de nombreuses équipes utilisant la SPR se sont équipées d’imageurs pour l’étude des interactions moléculaires sur puce, dont les plus emblématiques sont celles de Corn [9] et Lévy [10].
Les systèmes d’imagerie SPR sont basés sur un mode de suivi de l’interaction à angle de mesure et longueur d’onde fixes. Dans ce cas, une caméra CCD va permettre l’enregistrement des variations d’intensité du faisceau réfléchi exprimé sous forme de pourcentage de réflectivité. La réflectivité traduit ici le rapport entre l’intensité du faisceau réfléchi et celle du faisceau incident (Figure 2.3). Reflectivité (%) 2 ∆R 1 ∆θ Angle d’incidence (°)
L’imagerie SPR offre ainsi la possibilité de mener une détection multiparamétrique, sans marquage et permet par ailleurs une quantification des cinétiques observées. De plus, la visualisation de la surface de la biopuce en temps-réel permet d’identifier et limiter les phénomènes d’interaction non-spécifique [11]. Ces avantages en font alors incontestablement un outil de choix pour l’étude des interactions moléculaires.
Dispositif expérimental utilisé
Dans le cadre de ce projet de thèse, l’appareil de détection employé est constitué tel que présenté sur la Figure 2.4. Il est composé d’une partie fluidique assurant la circulation des différentes solutions durant l’expérimentation et une partie optique de type SPRi dans la configuration de Kretschmann. Développé par Horiba (France), ce système est composé de plusieurs éléments optiques (Figure 2.4). Une source monochromatique de lumière de type LED (λ = 635 nm) génère un faisceau lumineux dont l’angle d’incidence peut être ajusté par un miroir pivotant. Un polarisateur va alors permettre une polarisation de la lumière incidente en mode Transverse Magnétique (TM) pour la mesure SPR ou Transverse Electrique (TE) pour la réflectivité totale de référence. Le faisceau réfléchi est capté par une caméra CCD (16-bit) reliée à un ordinateur.
Le système est confiné dans une enceinte thermo-régulée afin de limiter l’effet des fluctuations de température sur les événements de reconnaissance et le phénomène de plasmons de surface (Figure 2.5).
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Table des matières
DES MATIERES
TABLE DES MATIERES
TABLE DES ABRÉVIATIONS
1. INTRODUCTION GÉNÉRALE
Avant-propos
1.1 Les aptamères comme éléments de reconnaissance
1.1.1 Caractéristiques structurales et propriétés
1.1.2 Sélection des aptamères
1.1.3 Applications
1.2 Application à la détection de petites molécules : l’adénosine comme modèle
1.2.1 Notions de petites molécules
1.2.2 L’adénosine et son aptamère
1.2.3 La détection de l’adénosine au moyen d’aptasensors
1.3 Objectifs de la thèse
BIBLIOGRAPHIE
2. ÉLABORATION DE LA BIOPUCE ET DÉTECTION PAR SPRi
2.1 L’imagerie par résonance des plasmons de surface (SPRi)
2.1.1 Le phénomène de résonance plasmonique
2.1.2 L’imagerie SPR
2.1.3 Dispositif expérimental utilisé
2.2 Conception de la biopuce
2.2.1 Séquences des aptamères utilisés
2.2.2 Immobilisation des aptamères sur la surface
2.3 Optimisation de la chimie de surface
2.3.1 La thrombine et ses aptamères
2.3.2 Traitements de surface
2.4 Application au modèle adénosine
2.5 Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
3. DÉTECTION DE L’ADÉNOSINE PAR AMPLIFICATION DU SIGNAL SPRi
3.1 Amplification du signal SPR
3.1.1 Introduction
3.1.2 Les nanoparticules comme agents d’amplification
3.1.3 Stratégie de détection développée
3.2 Caractéristiques et fonctionnalisation des nanoparticules d’or
3.2.1 Choix des nanoparticules d’or
3.2.2 Couplage aptamères-nanoparticules d’or
3.2.3 Stratégies de blocage des surfaces pour la réduction du signal non spécifique
3.2.4 Caractéristiques de la cinétique d’amplification par SPRi
3.3 Application à la détection d’adénosine
3.3.1 Détection via l’interaction des conjugués AuNPs-SplitAPT avec les sondes SplitAPT8
3.3.2 Détection au moyen des séquences sondes SplitAPT4
3.4 Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
4. DÉTECTION DE L’ADÉNOSINE PAR UTILISATION DES RAMPES DE TEMPERATURE
4.1 Introduction
4.2 Stratégies de détection de l’adénosine à partir des profils de dénaturation
4.2.1 Dispositif expérimental
4.2.2 Protocole de détection
4.3 Caractéristiques des profils de dénaturation
4.3.1 Cas des séquences SplitAPT8
4.3.2 Application à la détection d’adénosine à partir des séquences SplitAPT8
4.3.3 Gamme de détection
4.3.4 Influence du nombre de bases complémentaires
4.4 Considérations thermodynamiques
4.4.1 Généralités sur le modèle de Langmuir
4.4.2 Adaptation au modèle d’étude
4.5 Conclusion
BIBLIOGRAPHIE
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