LES ACTINOMYCETES COMME PRINCIPALES SOURCES DE METABOLITES SECONDAIRES ET AGENTS BIOLOGIQUES

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Les microorganismes rhizosphériques.

Les microorganismes sont très nombreux dans le sol et particulièrement actifs dans la rhizosphère grâce à l’exsudation de carbone organique effectuée par les racines lors du processus de rhizodéposition (Benizri et al., 2002; 2007). En effet, le flux des rhizodépots, de la racine vers la rhizosphère, constitue une source de carbone et d’énergie pour la microflore du sol (Hamdan, 2010). Il est estimé que 40 % du carbone assimilé par les plantes au cours de la photosynthèse est alloué au compartiment souterrain, avec des variations importantes suivant les espèces végétales et leur environnement. Le tiers de ce carbone permet l’élaboration de la biomasse racinaire, un second tiers est respiré par les racines, alors qu’un dernier tiers correspond à la rhizodéposition qui constitue une source d’énergie essentielle pour les microorganismes du sol (Hinsinger, 2010). Ainsi, la biomasse microbienne dans la rhizosphère vaut au moins le tiers de celle qui vit au-dessus du sol (Presott et al., 2008) et l’activité de la microflore y sont significativement plus élevées.

Diversité et spécificité des microorganismes rhizosphériques

De nombreuses recherches ont montré que la densité, la diversité et l’activité des microorganismes sont fortement élevées à proximité de la racine étant donné que c’est dans cette zone que ce manifeste l’effet rhizosphère (Hamdan, 2010). Parmi les microorganismes couramment rencontrés dans la rhizosphère se trouvent les bactéries dont la densité peut aller jusqu’à 109 par gramme de sol (Balasubramanian et Rangaswami, 1978), les champignons microscopiques environ 105 par gramme de sol (Soufiane, 1998 ; Morel, 1996), les virus, les algues, les protozoaires et un groupe très particulier qui est constitué par les actinomycètes ou bactéries filamenteuses dont la densité peut atteindre jusqu’à 107 par gramme de sol (Iwai et Takashi, 1992; Soufiane, 1998). Ils manifestent souvent un antagonisme vis-à-vis des autres bactéries et des champignons voisins; cet antagonisme résulte de la sécrétion de substances antibiotiques (Soufiane, 1998).

Propriétés et valorisations des microorganismes rhizosphériques.

Les microorganismes présents à proximité de la racine ont des propriétés différentes à celles du sol nu (sans végétation). Certains microorganismes rhizosphériques peuvent jouer un rôle majeur dans la décontamination du sol ou absorber les substances toxiques pour les transformer en composés moins toxiques (Paskiewicz, 2006). Ils jouent aussi un rôle dans la modification du pH du sol (acidification et alcalinisation) (Belyagoubi, 2014). Cependant, les rôles bénéfiques les plus connus sont l’amélioration de la croissance des plantes par divers mécanismes, la protection de la plante contre les agents pathogènes et l’amélioration de la propriété biotique et abiotique du sol (Schardl et al., 2004 ; Stefan et al., 2012). Il existe néanmoins des microorganismes rhizosphériques qui ne sont pas bénéfiques pour les plantes ou pour les autres organismes vivants dans le sol (Sharma, 2014). Ces agents pathogènes sont également capables de modifier les propriétés biologiques du sol et influencent ainsi négativement le développement des plantes (Sharma, 2014). Les interactions entre les microorganismes bénéfiques et non bénéfiques existent donc naturellement mais l’issue dépend généralement des propriétés du sol, de l’état physiologique de la plante et des aléas climatiques (Zhang et al., 2010).

Interaction entre la plante, le sol et les microorganismes

Il est connu depuis longtemps que la présence des microorganismes dans le sol affecte significativement la croissance des plantes (Ameur, 2011). Les interactions entre les microorganismes et la plante dans la rhizosphère sont nombreuses et variées. Les microorganismes présents dans le sol exercent une grande influence sur plusieurs mécanismes responsables de la santé et de la croissance des plantes. Ils régulent souvent la réponse de la plante aux stress environnementaux et contribuent au développement de celle-ci (Stefan et al., 2012). En effet, ces microorganismes contribuent au processus de croissance des plantes étant donné qu’ils s’activent dans le sol, rejoignent et stimulent l’ensemble de la microflore pour déclencher des réactions chimiques complexes qui sous-tendent les processus de transformation et de solubilisation des nutriments minéraux et organiques, et leur transport du sol vers la plante, pour être finalement absorbés par cette dernière (Robin,2012).

Les actinomycètes

Généralité sur les actinomycètes

Les actinomycètes sont des bactéries Gram positif avec un coefficient de Chargaff (% GC) élevé, allant de 51% chez certaines Corynebactéries, à plus de 70% chez les genres Streptomyces et Frankia, (Ventura et al., 2007). Ce sont des microorganismes procaryotes mais leur morphologie ressemble beaucoup à celle des champignons (eucaryote) à cause de la présence des filaments ramifiés et de sporulation au cours de leur croissance (Reponen et al., 1998). Toutefois, leurs propriétés chimiques, physiologiques, immunologiques les rangent parmi les procaryotes (Belyagoubi, 2014). Ces caractères s’ajoutent à d’autres comme le diamètre des hyphes, habituellement de 0,5 à 1µm (Eunice et Prosser, 1983), est deux à dix fois plus petit que celui des champignons (de 2 à 5µm) (Gottlieb, 1973) et confirment le bien-fondé de la classification des actinomycètes parmi les bactéries. Cette classification des actinomycètes est donnée dans l’annexe 3.

Structure des colonies d’actinomycète

Les colonies formées par les actinomycètes sur milieu solide sont très particulières. Elles résultent de l’accumulation des hyphes ramifiés et non pas de cellules comme le cas des bactéries non filamenteuses. Le diamètre des colonies est variable (1 à 10mm). L’aspect des colonies peut être compact, sec, lisse, rugueux à contours lisse ou échancrés. Elles sont souvent pigmentées (blanc, crème, jaune, violet, rose, gris) (Perry et al., 2004).

Ecologie et distribution

Les actinomycètes sont des microorganismes ubiquitaires et se rencontrent presque dans tous les habitats (Waksman, 1959) notamment le sol où ils jouent un rôle capital dans la décomposition des matières organiques même celles qui ne sont pas dégradables par les autres microorganismes. Le genre Streptomyces est le plus fréquent dans le sol.
Les eaux douces et marines constituent également des habitats pour les actinomycètes où l’on rencontre spécifiquement les genres Microspora, Actinoplanes et Streptosporangium. Les actinomycetes sont présents essentiellement dans les sédiments des fonds fluviaux et lacustres où ils jouent un rôle important dans la décomposition des débris végétaux et donnent à l’eau son odeur de terre ainsi que sa flaveur.

Importance environnementale et socio-économique des actinomycètes

 Sur le plan environnemental

Les actinomycètes ont un rôle important dans les processus de recyclage et de biodégradation de la matière organique et des éléments minéraux. Ils contribuent ainsi à la fertilisation des sols. Ils ont également une aptitude à dégrader les substances organiques complexes difficilement dégradables ou non par les autres microorganismes, tels que les polymères complexes, les polysaccharides, les lignocelluloses et la chitine (Goodfellow et Williams, 1983) grâce à leur capacité à produire une large variété d’hydrolases extracellulaires. Ils sont aussi capables de dégrader ou de recycler certaines toxines produites par des champignons toxinogènes.

Par ailleurs, les actinomycètes sont connus pour leur aptitude à produire des substances biologiquement actives non seulement sur la croissance des plantes mais aussi sur la fertilisation du sol telles les antibiotiques, les vitamines et les enzymes (de Boer et al., 2005). Certaines espèces ont la capacité à solubiliser le phosphore pour le rendre ainsi facilement accessible aux plantes (Crawford et al., 1993), d’autres sont également impliquées dans le contrôle phytopathologique et dans la production des composés antifongiques ou antibactériens (Riedlinger et al., 2006). La production des substances ayant un rôle important sur la croissance de la plante telle l’acide indole acétique qui influence plusieurs paramètres physiologiques chez la plante, à savoir l’élongation et la division cellulaire, la dormance apicale, la différenciation des tissus vasculaires, la production d’éthylène, l’initiation racinaire (Keyeo et al., 2011) et la prolifération racinaire aboutissant ainsi à une meilleure disponibilité en eau et en nutriments est également très courant chez les actinomycètes (Ashrafuzzamann et al., 2009).

 Sur le plan socio-économique :

Les actinomycètes jouent un rôle capital dans la production d’antibiotique. Ils gagnent en importance, car c’est la plus importante source de production d’antibiotiques et autres métabolites secondaires bioactifs (Valanarazu et al., 2009). C’est pour cette raison que ces microorganismes sont extrêmement pertinents pour les scientifiques pour être exploités dans les industries pharmaceutiques et agricoles (Kumar et al., 2010). Ainsi, un grand nombre d’antibiotiques actuellement utilisés, y compris l’érythromycine, streptomycine, la novobiocine, la nystatine, la rifamycine et la gentamicine sont tous des produits isolés à partir des actinomycètes du sol (Thakur et al., 2007; Jeffrey, 2008). Parmi les genres producteurs, Streptomyces qui est le plus connu comme premier producteur (environ 80 % des antibiotiques totales), ensuite le genre Micromonospora (Arifuzzaman, 2010). D’autres genres tels: Nocardia, Actinomadura, Actinoplanes, Nocardiopsis, et Saccharothrix sont aussi des producteurs d’antibiotiques.

En plus des antibiotiques antimicrobiens, les actinomycètes sont aussi une source de substances anti-tumorales, insecticides, antihelminthiques, pesticides, herbicides et des substances ayant des activités biologiques les plus diverses (Berdy, 2005).

Les actinomycètes comme principales sources de métabolites secondaires et agents biologiques

les différentes sources de métabolites secondaires

Les métabolites secondaires sont des substances naturelles synthétisées par un organisme vivant (animaux, végétaux et les microorganismes) qui sont responsables des fonctions indirectement essentielles à leur survie et leur développement (contrairement au métabolite primaire) telles que la communication intercellulaire, la défense, la régulation des cycles catalytiques. Ce concept est historiquement attribué à Kossel (Kossel, 1891) qui l’a introduit par opposition à celui de métabolites primaires. Ces derniers étant directement impliqués dans les grandes voies du métabolisme basal de la cellule. Tous les êtres vivant peuvent produire des métabolites secondaires à un moment précis de leur cycle de développement mais les plantes et les microorganismes semblent être les principaux producteurs.

 Les végétaux sont également parmi les organismes les plus étudiés comme

producteurs des métabolites secondaires. Ses composés secondaires regroupent plusieurs dizaines de milliers de molécules différentes, généralement rassemblés en superfamilles chimiques tel que les composés azotés dont les alcaloïdes, les composés phénoliques ou aromatiques dont les flavonoïdes, les isoprènoïdes ou terpènoïdes et les héterosides. Outre la très grande diversité chimique qu’ils représentent, ces métabolites secondaires se caractérisent généralement par de faibles concentrations dans les tissus végétaux (généralement quelques pourcents du carbone total, si on exclue la lignine de cette catégorie) ainsi que par leur stockage souvent réalisé dans des cellules ou organes dédiés. Pour ce qui concerne leurs fonctions chez les plantes, les métabolites secondaires exercent un rôle majeur dans l’adaptation des végétaux à leur environnement. Ils assurent des fonctions clés dans la résistance aux contraintes biotiques (phytopathogènes, herbivores) et abiotiques (UV, température). Du point de vue pharmacologique, les métabolites secondaires constituent la fraction la plus active des composés chimiques présents chez les végétaux et on estime aujourd’hui qu’environ 1/3 des médicaments actuellement sur le marché contiennent au moins une substance végétale (Newman et Cragg, 2012)

 Chez les microorganismes, les métabolites secondaires sont définis comme des composés de faible poids moléculaire, non essentiels à la croissance du microorganisme producteur. La production de ces métabolites est souvent associée à la phase stationnaire de la courbe de croissance du microorganisme en question (Demain, 1995; Saffroy, 2006). Les métabolites secondaires produits par les microorganismes les plus étudiés sont les antibiotiques et le premier producteur d’antibiotique parmi tous les microorganismes est l’actinomycète comme il est montré dans le tableau ci-après (tableau 2).

METHODES

Isolement des souches d’actinomycète

Cette étape a pour objectif d’isoler des souches d’actinomycète à partir des échantillons du sol rhizosphérique du margose. Le milieu utilisé pour l’isolement est un milieu sélectif pour les actinomycètes: le milieu Waksman solidifié, préalablement stérilisé à l’autoclave à 120°C pendant 20min et sous une pression égale à 1bar.

Préparation de la suspension dilution

Pour chaque échantillon, 5g de sol rhizosphérique, préalablement séché à la température ambiante pendant 24 heures, ont été pesées et mis en suspension dans 45ml d’eau distillée stérilisée. La suspension du sol ainsi obtenue est homogénéisée sur un agitateur magnétique pendant 15 minutes et cela correspond à la dilution 10-1. Puis après agitation au vortex, 100µl de la dilution 10-1 ont été prélevés puis mélangés avec 900µl d’eau distillée stérilisée et ce qui correspond à une dilution 10-2. Les dilutions en cascade ainsi commencées ont été continuées jusqu’à l’obtention de la dilution 10-4.

Etalement sur milieu de culture solide

Pour l’étalement, 100µl de chaque solution préalablement diluée à 10-2,10-3 et 10-4 ont été ensemencés puis étalés, à l’aide d’un racloir stérile, dans des boites de Pétri contenant le milieu Waksman solidifié. Pour chaque dilution trois répétitions ont été effectuées. Les boîtes de Pétri ont été ensuite incubées à une température de 30°C pendant 7 jours.

Observation des caractères morphologiques des souches

Après 7 jours d’incubation, les caractéristiques morphologiques des colonies apparues dans chaque boite de Pétri ont été observées à l’œil nu. La présence de mycélium végétatif diffusé à la surface du milieu de culture a servi à la reconnaissance visuelle des colonies d’actinomycète. Ensuite, chaque colonie d’actinomycète identifiée d’après leurs caractères morphologiques a été par la suite isolée sur des nouveaux milieux de culture (milieu Waksman solidifié) pour une purification et l’étude de leur activité fonctionnelle.

Evaluation de l’activité antagoniste des souches d’actinomycète

L’antagonisme des souches d’actinomycète a été évalué vis-à-vis d’une espèce de champignon phytopathogène, Fusarium oxysporum. Cette activité se manifeste par l’inhibition de la croissance mycélienne du champignon phytopathogène lorsqu’ils sont cultivés ensembles. L’objectif de cette étape est donc de sélectionner, parmi les souches d’actinomycète isolées à partir du sol rhizosphérique du margose, celles qui sont capables d’inhiber la croissance de cet agent phytopathogène.

Repiquage des souches d’actinomycète

A l’aide d’une anse stérile, chaque souche d’actinomycète pure est ensemencée respectivement sur le milieu de culture PDA (Potatoes Dextrose Agar) en faisant des stries très serrées. Toutes les boites ainsi cultivées ont été incubées dans une étuve de 30°C pendant 24h.

Dépôt de la souche de Fusarium oxysporum

Lorsque les souches d’actinomycète ont bien repris leur phase de croissance, la souche phytopathogène sous forme de disque de mycelium de 1,5mm de diamètre a été ensuite déposée sur le même milieu à une distance d=3cm du début des stries de colonies d’actinomycète et symétriquement par rapport au centre de la boîte de Pétri (figure n°3).

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Table des matières

INTRODUCTION
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. LA RHIZOSPHERE DES PLANTES
II. LES MICROORGANISMES RHIZOSPHERIQUES.
II-1. Diversité et spécificité des microorganismes rhizosphériques
II-2. Propriétés et valorisations des microorganismes rhizosphériques
II-3. Interaction entre la plante, le sol et les microorganismes
III. LES ACTINOMYCETES.
III.1. Généralité sur les actinomycètes
III.2. Structure des colonies d’actinomycète
III.3. Ecologie et distribution
III.4. Importance environnementale et socio-économique des actinomycètes
Sur le plan environnemental
Sur le plan socio-économique :
IV. LES ACTINOMYCETES COMME PRINCIPALES SOURCES DE METABOLITES SECONDAIRES ET AGENTS BIOLOGIQUES.
IV.1. Les différentes sources de métabolites secondaires.
IV.2. La lutte biologique
MATERIELS ET METHODES
SECTION I : LES MATERIELS D’ETUDE
I. LA PLANTE D’ETUDE
II. LES SOUCHES MICROBIENNES
II.1. Origines des Souches
II.2. Le sol rhizosphérique
SECTION 2 : METHODES
I. ISOLEMENT DES SOUCHES D’ACTINOMYCETE
I.1. Préparation de la suspension dilution
I.2. Etalement sur milieu de culture solide
II. OBSERVATION DES CARACTERES MORPHOLOGIQUES DES SOUCHES
III. EVALUATION DE L’ACTIVITE ANTAGONISTE DES SOUCHES D’ACTINOMYCETE
III.1. Repiquage des souches d’actinomycète
III.2. Dépôt de la souche de Fusarium oxysporum
III.3. Lecture des résultats
IV. MESURE DES ACTIVITES BIOLOGIQUES DES METABOLITES SECONDAIRES
IV.1. Fermentation en milieu solide
IV.2.Extraction des métabolites secondaires
IV.3. Test d’activité antimicrobienne des métabolites secondaires
IV.3.1. Revivification et rajeunissement des germes tests
IV.3.2. Ensemencement des germes tests et dépôt des disques
RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I.CARACTERISTIQUES MORPHOLOGIQUES DES SOUCHES D’ACTINOMYCETE ISOLEES22
II. PROPRIETE ANTAGONISTE DES SOUCHES D’ACTINOMYCETE ISSUES DE LA RHIZOSPHERE DE MARGOSE
III. ACTIVITE BIOLOGIQUE DES METABOLITES SECONDAIRES DES SOUCHES D’ACTINOMYCETE
DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES