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Applications de l’impédance à l’analyse des cellules
Les propriétés électriques des cellules donnent des informations pouvant contribuer à la compréhension de l’état physiologique complexe de la cellule. En effet, des anomalies cellulaires ou des infections bactériennes peuvent par exemple être à l’origine de la modification de l’activité de certains canaux ioniques, de la conductivité ou de la résistance du cytoplasme voire de son facteur de déformabilité (variation de la résistance membranaire)18. Lorsqu’une cellule adhère, se développe ou meurt à la surface d’une électrode, les caractéristiques électriques de la couche cellulaire changent conduisant à une modification de l’impédance19,20. Ainsi, la mesure des propriétés électriques des cellules ont d’ores et déjà été mises à profit au travers de la mesure d’impédance pour le comptage, la séparation, le piégeage et la caractérisation de cellules ainsi que pour le développement de dispositifs pour le diagnostic. On parle alors de spectroscopie cellulaire diélectrique, l’analyse impédimétrique de cellules pouvant être réalisée de manière individuelle ou collective.
Comme l’illustre le schéma ci-dessous un grand nombre d’applications basées sur ce principe ont vu le jour.
Analyses collectives
Giaever et Keese ont été les premiers à démontrer les variations de l’impédance électrochimique lorsqu’une population de cellules se déplace à la surface d’une électrode21,22 ou subit des modifications morphologiques23. Lorsque des cellules sont déposées à la surface d’électrode, leur caractère isolant engendre une forte augmentation de l’impédance proportionnellement au nombre de cellules couvrant l’électrode. Lorsque les cellules changent de morphologie ou se détachent de l’électrode, l’impédance chute. L’optimisation de la sensibilité de l’unité de détection représente donc une étape très importante dans la conception de capteurs électrochimiques (impact majeur de la conception de l’électrode sur la réponse électrique du biocapteur). De plus, suivant la fréquence du signal, différentes caractéristiques de la cellule peuvent être ciblées. Ainsi comme l’illustre la Figure I-8, aux fréquences relativement faibles (< 2000 Hz), le courant circule majoritairement sous, et entre les cellules adjacentes (lignes rouges) alors qu’aux fréquences plus élevées (> 40 000 Hz), le courant traverse les membranes cellulaires isolantes (lignes vertes).
Les mesures d’impédance à hautes fréquences sont donc plus impactées par le recouvrement cellulaire de surface active, tandis que les réponses impédimétriques à basses fréquences sont plus influencées par des changements d’espaces entre ou sous les cellules. L’influence de la fréquence sur les valeurs de résistance et de capacité, avec ou sans cellules, est représentée par les graphiques suivants présentés Figure I-9.
Il est important de noter que la constante diélectrique de l’eau est elle aussi dépendante de la fréquence.
En utilisant de multiples fréquences, les données d’impédance recueillies par SIE peuvent renseigner sur des changements mesurés en temps réel sur :
• la perméabilité de la couche cellulaire,
• la capacité de la membrane cellulaire, démontrant ainsi la capacité du courant à circuler dans les cellules.
Ces analyses collectives présentent donc l’avantage de proposer des études en temps réel et sans marquage.
Différenciation cellulaire
La spectroscopie d’impédance électrochimique a souvent été mise en œuvre pour la caractérisation de la différenciation cellulaire. La différenciation cellulaire est un concept de biologie du développement décrivant le processus par lequel les cellules se spécialisent en un « type » cellulaire. La morphologie d’une cellule peut changer radicalement durant la différenciation, mais le matériel génétique reste le même, à quelques exceptions près. Bagnaninchi et Drummond24 ont par exemple caractérisé la différenciation de cellules souches du tissu adipeux en adipocytes et ostéoblastes. Quatre jours après l’induction, les cellules se distinguent suivant leurs valeurs de capacitance membranaires comme l’illustre les variations de l’impédance mesurées à une fréquence caractéristique en fonction du temps (Figure I-10).
Les mesures d’impédance peuvent également faciliter l’observation des effets des facteurs environnementaux sur la différenciation cellulaire. Les travaux de Angstmann et al.25 ont démontré des profils d’impédance différents lorsque des substrats ECM (matrice extracellulaire) sont mélangés à du collagène, de la fibronectine, ou de la laminine. Cho et al.26 ont utilisé des mesures d’impédance pour tester les effets de chlorpyrifos (pesticides) sur la différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines en adipocytes. D’autres observations impédimétriques ont été réalisées sur la différenciation ostéogénique et adipogénique de cellules souches humaines mésenchymateuses (Hildebrandt et al.27), la différenciation neuronale de ces mêmes cellules (Park et al.28), ou encore sur la transition épithélio-mésenchymateuses (Schneider et al.29).
De plus, depuis que les mesures d’impédance peuvent s’effectuer en temps réel, les différentes phases de la mitose et du cycle cellulaire peuvent être suivies. Ghenim et al.30 a observé sur des cellules de carcinome épithélioïde de col de l’utérus humain (HeLa) que l’impédance augmente au cours de la prophase (division cellulaire), de la métaphase, et diminue au cours de l’anaphase. Wang et al.31 ont quant à eux montré que pendant le cycle cellulaire des cellules HeLa, l’impédance augmente au cours des phases G1 et S mais diminue au cours des phases G2 et M. Ces résultats montrent que les phases du cycle cellulaire peuvent être discriminées par l’intermédiaire de la mesure des variations d’impédance de la cellule, ce qui peut fournir un outil utile pour les études concernant le cycle cellulaire et l’impact de substances actives.
La SIE a également été utilisée afin de caractériser les changements affectant une cellule lors du développement intracellulaire d’un parasite. Ainsi , des travaux antérieurs de l’équipe Redstress ont permis de mettre en évidence des changements d’impédance importants liés à la production d’espèces redox ou à la perméabilisation membranaire dans le cas de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum (agent du paludisme) ou de macrophages parasités par Lesishmania amazonesis32. De la même manière, l’équipe de V. Senez a développé un système permettant le suivi in vitro par spectroscopie d’impédance en temps réel de l’infection de cellules cancéreuses HCT-8 par un protozoaire parasite Cryptosporidium parvum33. Ces études ont permis de corréler le cycle de développement intracellulaire du parasite aux variations d’impédance mais également de quantifier l’infectivité d’un inoculum c’est-à-dire le taux de parasites potentiellement infectants34.
Mesure d’adhérence
Lorsque les cellules adhèrent et se propagent à la surface d’une électrode, elles conduisent à une augmentation de l’impédance électrique. L’instrument xCELLigence, fabriqué par Roche, utilise cette technique pour mesurer les changements d’impédance électrique lorsque des cellules adhèrent et se répandent dans une boîte de culture dont le fond des puits est recouvert à 80 % environ par une matrice de microélectrodes d’or. L’impédance est affichée en tant que paramètre appelé indice de cellule (sans dimension), et est directement proportionnelle à la surface totale de culture. Le dosage de l’invasion est basé sur des changements d’impédance électrique au niveau de l’électrode / cellule en interphase. Ainsi, la cellule-index peut être utilisée pour contrôler l’adhérence des cellules, leur étalement, leur morphologie ou leur densité.
Ce type de mesures trouve des applications en oncologie. En effet, une fois dans le système circulatoire, les cellules cancéreuses adhèrent aux parois capillaires et traversent les tissus environnants pour former des tumeurs métastatiques. Les différentes composantes de l’interaction cellulaire des cellules endothéliales tumorales peuvent être reproduites in vitro en utilisant une monocouche de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) et des cellules cancéreuses. La technique SIE permet alors le suivi et la quantification en temps réel des interactions des cellules endothéliales avec les cellules tumorales. En effet, la perturbation des jonctions endothéliales, la rétraction de la monocouche endothéliale et le remplacement par des cellules tumorales conduisent à de grandes variations d’impédance. Ces modifications sont en corrélation directe avec la capacité invasive des cellules tumorales. Cette technique possède un double avantage par rapport aux méthodes existantes de mesure d’invasion, telles que la chambre de Boyden (système formé de deux compartiments séparés par une membrane poreuse à travers laquelle les cellules peuvent migrer) ou les analyses matrigel (mélange de protéines gélatineuses utilisé pour la culture cellulaire) :
– l’interaction cellulaire des cellules tumorales et endothéliales imite au plus près le procédé in vivo,
– les données sont obtenues en temps réel et le phénomène est plus facilement quantifiable.
Cytotoxicité et criblage de substances bioactives
La spectroscopie d’impédance électrochimique peut aussi être utilisée pour mettre en évidence la cytotoxicité d’une substance bioactive. Dans ce cas, les cellules mortes s’exposent non seulement au détachement (changements dans l’adhérence au substrat) et à la diffusion, mais réduisent également leur affinité vis-à-vis des autres cellules, ce qui se traduit par une modification de l’impédance électrochimique. Les tests de cytotoxicité classiques consistent à faire varier la concentration de substances toxiques pour les cellules et à enregistrer les variations d’impédance provoquées. Dans ces configurations, la cellule est utilisée en tant que biocapteur pour des mesures rapides et en temps réel, pouvant remplacer les tests de cytotoxicité traditionnels, lents et invasifs.
Analyse individuelle
Comptage individuel type Coulter
La cytométrie de flux consiste à analyser en milieu liquide les signaux optiques ou physiques émis par une cellule traversant un faisceau lumineux afin de les caractériser individuellement, de manière quantitative et qualitative. Elle a été développée en 1934 pour le comptage des constituants cellulaires du sang, puis, associée à des méthodes électrostatiques et d’immunofluorescence. En plus de l’analyse des cellules, la cytométrie de flux permet aussi d’effectuer du tri cellulaire, ses principales applications restant le diagnostic de maladies. La détection repose alors soit sur la mesure du contenu anormal d’ADN dans le noyau de la cellule à caractère pathologique, soit sur l’identification des sous-populations cellulaires impliquées dans l’immunité par immunophénotypage.
Cette méthode analytique basée sur la détection laser, est utilisée pour des analyses multiparamétriques comme la détection et le comptage de cellules, protéines ou biomarqueurs. En plus de leur polyvalence et de leur capacité de détection, les analyses à haut débit de cellules uniques peuvent être appliquées à des études de recherche de base, des pratiques cliniques et des essais. Cependant, les cytomètres actuels, basés sur de la mesure optique, sont coûteux et encombrants ; de plus, ils nécessitent une expertise spécialisée et sont inappropriés aux applications au chevet du patient ou « point-of-care » (POC, test effectué et interprété à l’endroit et au moment où il a été réalisé, en vue d’une décision clinique). Il existe d’autres méthodes d’analyses alternatives.
Les compteurs Coulter sont apparus dans les années 50. La technologie a été développée principalement pour compter rapidement les globules en mesurant les variations de conductivité électrique liées à la présence des cellules en suspension dans un fluide conducteur48. Malgré sa capacité limitée pour le comptage et le dimensionnement, la simplicité et le bas coût de la méthode de détection électrique rendent ces compteurs particulièrement adaptés à la réalisation de dispositifs portables. Actuellement, plus de 98% des compteurs de cellules automatisés incorporent cette technologie, désignée comme le Principe Coulter. Celui-ci repose sur la mesure d’impédance entre deux électrodes dans un petit orifice pouvant être traversé par la cellule. Étant donné que la membrane cellulaire joue le rôle de couche isolante, la présence de la cellule modifie la résistance de l’orifice par remplacement du liquide conducteur.
Ces compteurs ont également bénéficié des avancées du domaine de la microfluidique. Dans ce cas, le principe de fonctionnement se base sur un compromis technique entre la taille des microcanaux, le haut débit et la sensibilité : un canal de grande taille sera préféré pour un dispositif à haut débit, tandis qu’un canal de petite taille pourra fournir une meilleure sensibilité. De plus, un problème de diaphonie inter-canaux est souvent repéré. C’est pourquoi, au risque de limiter la sensibilité, le partage des électrodes de polarisation est effectué dans le même canal (une entrée et une sortie). Jagtiani et al. ont réussi à limiter cette diaphonie en appliquant des fréquences multiples pour chaque canal49.
En raison de la complexification des designs des circuits conduisant à une bande passante limitée, Kim et al. ont exploré un cytomètre multicanal pour l’analyse à haut débit, mais leur conception du canal horizontal a limité l’évolutivité du principe vers une plus grande densité cellulaire50. De même, Damhorst et al. ont mis au point un compteur Coulter submicrométrique pour comptabiliser des nanoparticules dans un tampon, dont plusieurs espèces de virus (détermination des caractéristiques structurelles et identification de nouveau virus)51. Cette technologie complète les travaux antérieurs sur la cytométrie de flux pour le dénombrement des lymphocytes T CD4+52. Le comptage direct des particules a été étendu à la détection d’exosomes humains (vésicules extracellulaires) ce type de comptage ayant plusieurs applications potentielles dans le diagnostic de maladie53.
Cependant, l’une des difficultés des compteurs Coulter microfluidiques, réside dans le choix du matériau de l’électrode. Les électrodes Ag/AgCl non polarisables, qui fonctionnent bien dans un compteur Coulter conventionnel, sont un choix idéal. Néanmoins, les électrodes Ag/AgCl ont une durée de vie limitée et leur intégration dans des canaux microfluidiques reste complexe. Bien que d’autres électrodes métalliques puissent être plus facilement intégrées dans des canaux microfluidiques, les doubles couches électriques formées à l’interface électrode/liquide, principalement capacitives, posent des difficultés dans l’application de signaux. La modification de la rugosité de surface de l’électrode (afin d’augmenter l’aire de surface) peut être une solution pour réduire au minimum l’effet de double couche électrique.
Plus récemment, un micro-cytomètre basé sur des mesures d’impédance, intégrant des PGE (polyelectrolyte gel electrodes) a été utilisé pour la détection de cellules tumorales circulantes (CTC). L’écoulement dans la gaine a été optimisé pour se focaliser sur les cellules et empêcher leur adhérence dans les chambres de piégeage sur les parois des canaux (Figure I-11).
Les CTC ont ainsi été détectées avec succès dans des échantillons de sang provenant de 105 patientes atteintes du cancer du sein54. En raison de la configuration des électrodes et de la géométrie des canaux, le modèle utilisé dans les compteurs Coulter classiques pour le calcul des volumes de particules, n’est pas directement applicable aux compteurs Coulter microfluidiques55. Un compteur Coulter microfluidique est donc limité au comptage et au dimensionnement des cellules individuelles sans pouvoir caractériser leurs propriétés électriques.
Enfin, les compteurs Coulter peuvent être également potentiométriques. En Effet, Chen et al.56, ont réalisé un compteur Coulter à haut débit avec de nombreux canaux verticaux microfluidiques (réseau de haute densité) et une configuration à trois électrodes permettant des mesures potentiométriques.
Analyse de la cellule unique
L’évaluation du métabolisme, de la mobilité, de la croissance et de la prolifération cellulaire est généralement basée sur l’étude de populations de cellules. Les propriétés biophysiques et biochimiques de la cellule sont alors une moyenne estimée à partir de l’ensemble des cellules sans tenir compte de l’hétérogénéité cellulaire notamment au niveau de l’expression de gènes spécifiques. Les analyses de cellules uniques sont par conséquent essentielles à la compréhension de certaines questions fondamentales, telles que la différenciation biologique, biochimique et fonctionnelle des cellules. C’est aussi un élément clé pour le diagnostic précoce du cancer57.
En biologie cellulaire, l’analyse unicellulaire se réfère à l’étude de cellules individuelles isolées à partir de tissus d’organismes multicellulaires. Une fois la cellule isolée il est alors possible d’étudier sa migration, sa division ou sa différenciation en présence par exemple de molécules bioactives. L’étude de la division cellulaire est notamment intéressante dans le domaine du cancer en raison du taux de prolifération incontrôlée des cellules cancéreuses par rapport à une cellule normale. Les modèles génétiques et l’expression de protéines peuvent expliquer le comportement cellulaire dans une large mesure, mais l’étude dynamique des cellules vivantes peut augmenter la compréhension des événements moléculaires d’interconnexion qui ont lieu en permanence dans la cellule. Chaque cellule est plus ou moins différente de l’autre, même dans un même type de cellule. L’hétérogénéité cellulaire est bien connue dans la bactérie et de plus en plus mise en évidence dans les cellules eucaryotes.
Pendant longtemps, il a été admis que les cultures de cellules étaient de nature homogène, et que l’analyse d’une collection de cellules pouvait donner une évaluation précise du comportement des cellules dans la culture ou un tissu. La réponse moyenne des cellules a été, et est encore souvent interprétée comme la réponse de toutes les cellules dans cet échantillon. En outre, l’effet du nombre de cellules sur le comportement de la cellule était, et est encore souvent négligé en raison de difficultés dans le suivi de ces phénomènes. L’analyse impédimétrique de cellules uniques58 s’est donc récemment développée et constitue aujourd’hui un outil essentiel pour comprendre les caractéristiques biologiques de la cellule. Elle présente un intérêt dans divers aspects de la médecine, comme par exemple la régénération des tissus nerveux endommagés, l’isolement d’une sous-population cellulaire présente dans un échantillon complexe, ou encore le criblage à haut débit de nouvelles substances bioactives. Elle est effectuée, comme dans le cas des analyses collectives, au travers de l’étude des variations d’impédances induites par des phénomènes tels qu’une modification d’adhérence, de l’activité de certains canaux ioniques ou de l’expression de protéines.
Pour cette raison un certain nombre de dispositifs microfluidiques tendant à piéger une cellule unique ont vu le jour. Jang et al. ont ainsi mis au point un dispositif microfluidique pour capter et mesurer l’impédance d’une seule cellule Hela en utilisant des dispositifs hydrauliques de piégeage comportant des micro-piliers59. Ces dispositifs ont permis de suivre en continu l’effet d’agents tensio-actifs et de toxines porogènes bactériennes sur ces cellules HeLa. De plus, pour réduire au minimum les fuites de courant, dues aux lignes de courant extérieures à la cellule, Cho et al. ont développé une gamme de micro-trous permettant de positionner les cellules au centre des lignes de courant. La figure ci-dessous illustre ce dispositif.
De la même manière, Kang et al.60 ont développé un dispositif microfluidique permettant la différenciation par SIE entre une cellule prostatique normale et une cellule prostatique cancéreuse, en parallèle des méthodes classiques comme la biopsie (méthode entrainant de nombreuses erreurs de diagnostic). Cette méthode par SIE a donc pour but d’améliorer le taux de détection du cancer de la prostate.
Ce système comprend une membrane déformable en PDMS (polydiméthylsiloxane), actionnée par l’application d’une pression pneumatique, afin de capturer une cellule unique à la surface des électrodes de détection. Au centre du canal, une structure en tunnel, de diamètre avoisinant le diamètre cellulaire (environ 30 µm) pour concentrer l’intégralité du champ électrique dans la cellule, est insérée afin d’effectuer le piégeage. L’importante surface de contact entre la cellule piégée et l’électrode permet de mesurer, avec une haute sensibilité, les caractéristiques électriques de chaque cellule. La différenciation s’effectue suivant la variation de la réponse électrique à fréquence fixe (8,7 kHz) entre les cellules humaines normales de la prostate (RWPE-1) et les cellules cancéreuses (PC-3) (Figure I-13).
Microscopie par mesure d’impédance électrochimiqu
La SIE est donc un outil essentiel pour la détection sans aucun marquage de processus cellulaires comme l’étalement, l’adhésion, l’invasion, la toxicologie et la mobilité cellulaires. Toutefois, les données recueillies manquent souvent d’informations spatiales, essentielles à l’étude des processus hétérogènes et à l’imagerie des puces à haut débit.
Pour apporter des solutions à ce problème, Wang et al.61 ont utilisé un microscope d’impédance électrochimique (EIM, electrochemical impedance microscope) basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR, Surface Plasmon Resonance). Dans ce cas, par opposition à la SIE conventionnelle qui mesure un courant, le microscope est basé sur l’analyse de plusieurs signaux. Un faisceau laser est dirigé sur une surface recouverte d’or sur laquelle sont cultivées la ou les cellules. Une différence de potentiel alternative est appliquée à l’électrode par rapport à une électrode de référence insérée dans le milieu de culture. L’image EIM est créée à partir des changements SPR induits par la polarisation électrique. En plus des images SPR et EIM, une image optique classique du même échantillon est également enregistrée.
L’EIM cible les conductivités et polarisabilités électriques locales, reflétant les changements locaux de structures cellulaires et de distributions ioniques (cette information n’étant pas accessible à partir de microscopes classiques). Ce microscope a par exemple permis de suivre l’apoptose ou l’électroporation de cellules individuelles avec une résolution submicrométrique d’une milliseconde. La résolution spatiale et temporelle permet d’étudier les cellules individuellement, mais aussi de résoudre les structures et les processus subcellulaires avec une excellente sensibilité de détection (~ 2 pS). Les images cellulaires du microscope sont simulées suivant un modèle basé sur la constante diélectrique locale et la conductivité.
Un dispositif impédimétrique commercial, le capteur multiparamétrique, Bionas 2500®
C’est un système d’analyse, développé en 2001 par l’entreprise Bionas GmbH (Rostock, Allemagne), sous forme de multi-capteurs pour l’analyse cellulaire. Cet outil permet de suivre trois paramètres : l’acidification péricellulaire par mesure du pH, la respiration cellulaire en suivant la consommation d’oxygène et l’adhésion ou la prolifération cellulaire par mesure d’impédance. Ce système permet par exemple de suivre le métabolisme cellulaire mais aussi de cribler des substances actives, bien que le débit d’analyse soit modeste. Deux systèmes sont à la base de ce développement :
– le système créé par Giaever et Keese62, maintenant produit par Applied Biophysics, Inc. (Troy, NY 12180, États-Unis, http.// www.biophysics.com) avec pour nom commercial ECIS® (electric cell-substrate impedance sensing). Ce système, comme nous l’avons vu précédemment permet de suivre en temps réel par impédancemétrie des phénomènes tels que l’adhésion, la migration et la mobilité cellulaire ;
– le Cytosensor. ®, un dispositif construit par Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA) équipé d’un capteur potentiométrique, capable de détecter l’acidification
péricellulaire, directement liée au métabolisme cellulaire63 (sa production a été arrêtée en 2001). Avec le développement de la microfluidique, les deux systèmes ont trouvé des applications similaires dans de nombreux domaines. Cependant, la limitation de ces dispositifs réside dans le fait qu’ils ne donnent accès qu’à un seul paramètre et de ce fait la recherche s’est orientée vers la conception de nouveaux capteurs multiparamétriques64.
Le dispositif Bionas 2500® est composé d’une unité centrale, d’un système fluidique avec auto-échantillonneur et d’une unité de commande (Figure I-16). L’unité centrale est constituée de six bio-modules comprenant chacun une puce de mesure. Le système contient en tout cinq capteurs dédiés à des mesures de pH (acides lactique et carbonique générés lors de l’élimination de produits finaux du métabolisme cellulaire), deux électrodes de Clark pour la consommation d’oxygène (variation de la concentration en fonction de l’activité respiratoire des cellules) et une électrode interdigitée pour les mesures d’impédance cellulaire. Enfin, une diode de température complète l’équipement du capteur.
Présentation générale du laboratoire sur puce
Principe général
Le dispositif est basé sur un double tri immunologique opéré par l’intermédiaire de microbilles paramagnétiques fonctionnalisées suivi d’un comptage collectif des cellules en utilisant une technique électrochimique, permettant ainsi d’atteindre des temps d’analyse courts. Cette approche offre la perspective d’intégrer les étapes de préparation et de purification de l’échantillon sur la même plateforme et ouvre donc la possibilité ultérieure de l’automatisation de l’analyse. Elle est également compatible à terme avec un objectif de dispositifs totalement portables et donc d’une utilisation plus près du patient ou du personnel déplacé.
Choix des cellules
Compte-tenu de la forte récurrence des monocytes15,16 (MO) comme marqueur d’un processus infectieux, d’une inflammation chronique et du développement tumoral, les premiers types cellulaires choisis pour valider le dispositif seront les monocytes inflammatoires du sang. Le changement de la formule sanguine, notamment de la population monocytaire, est un très bon indicateur de l’apparition d’une pathologie à un stade précoce. Les monocytes circulants du sang sont les cellules clés qui relient le système immunitaire inné et l’immunité adaptative. Ils jouent un rôle décisif dans de nombreuses pathologies inflammatoires et infectieuses. Ils proviennent d’un précurseur myéloïde et donnent naissance à différents sous-types de macrophages tissulaires et de cellules dendritiques (Figure II-1).
Les monocytes du sang font partie de la famille du système phagocytaire mononucléaire qui joue un rôle central dans l’immunorégulation et la défense immunitaire contre les organismes pathogènes17. Ces cellules, mesurant environ 15 µm, interviennent dans les phénomènes inflammatoires et dans la synthèse de nombreux facteurs de croissance. Elles appartiennent à la première ligne de défense contre les infections bactériennes, fongiques, parasitaires ou virales et exercent des fonctions de phagocytose et des fonctions sécrétrices. Lors des infections, les MO contribuent directement à la défense immunitaire grâce à leur fonction phagocytaire mais aussi grâce à leur activation par des organismes infectés ou des médiateurs inflammatoires, ainsi que par des facteurs chimiotactiques libérés par les autres cellules qui modulent le processus inflammatoire et déclenchent la réponse immunitaire adaptée.
Ces cellules constituent une population hétérogène18 et peuvent être classés en trois sous-groupes sur la base de l’expression du CD14 (récepteur aux lipopolysaccharide (LPS)) et du CD16 (récepteur FcγIIIR) (Figure II-2).
Les monocytes classiques sont CD14++ CD16-, les monocytes intermédiaires sont CD14++ CD16+ et les monocytes associés aux pathologies inflammatoires et infectieuses sont CD14+ CD16++. Le ratio des monocytes CD16+/CD16- dans le sang augmente significativement au cours de pathologies infectieuses (septicémies19, athérosclérose20, infections HIV21).
Dans cette thèse, toutes les expériences portant sur le piégeage immunologique seront réalisées à partir de monocytes de lignées cellulaires THP-1 (annexe 1).
Description du dispositif développé
Le système développé peut être décomposé en deux modules successifs :
• le premier module est destiné à l’isolement des monocytes des autres constituants du sang : il sera réalisé grâce à l’utilisation de billes magnétiques fonctionnalisées avec l’anticorps anti-CD14 capable de reconnaitre le récepteur CD14 présent sur le monocyte. Le tri magnétique présente l’avantage d’être facilement miniaturisable et utilisable avec de très petits volumes d’échantillon. Il a été démontré très récemment la possibilité d’intégrer des microsources magnétiques sous la forme de microbobines dans des systèmes microfluidiques tout polymère. Les fonctions de tri et de piégeage magnétiques ont pu ainsi être validées. Le défi majeur dans la conception de systèmes de séparation micro-magnétique reste toutefois l’obtention d’une séparation efficace en flux continu.
• le second module permet de trier spécifiquement les monocytes proinflammatoires grâce à leurs récepteurs CD16. Le tri et le comptage seront réalisés par l’intermédiaire d’électrodes fonctionnalisées avec des anticorps anti-CD16. Les cellules ainsi immobilisées sur l’électrode sont comptées par spectroscopie d’impédance électrochimique.
La plupart du temps le comptage se fait par l’intermédiaire de techniques optiques qui nécessitent des montages expérimentaux compliqués et des échantillons marqués. L’utilisation de techniques de comptage ne nécessitant pas de marquage fluorescent des cellules permet de diminuer considérablement la complexité des systèmes, les rendant plus appropriés pour la réalisation de dispositifs portables. La spectroscopie d’impédance fait partie des méthodes capables de surmonter certaines de ces limitations. Comme évoqué précédemment, cette technique a évolué vers des systèmes fluidiques utilisant des électrodes intégrées dans les canalisations et permettant le comptage individuel ou collectif des cellules en fonction de leurs caractéristiques électriques (propriétés diélectriques).
Phase de marquage
Une première zone permet le marquage sélectif de l’échantillon cellulaire par des microbilles fonctionnalisées (mixing stage). L’échantillon sanguin est introduit puis mélangé à un tampon contenant des microbilles magnétiques dont la surface a été préalablement fonctionnalisée par des anticorps anti-CD14. Dans cette zone de marquage, les monocytes se fixent sur les billes par interaction antigène/anticorps. Des travaux antérieurs montrent toute l’importance de cette zone (Thèse S. Cargou22). La solution la plus fréquemment implémentée est celle d’un marquage par mélange/incubation. Le mélange peut être réalisé de manière homogène par l’intermédiaire d’une série de ponts 3D, ou de micro-mélangeurs à transformée du boulanger. Cette partie du travail ainsi que le développement du module de séparation ont été pris en charge dans le cadre de la thèse de Marc Fouet (M. Fouet, février 2016).
Une fois passées dans cette phase de micro-mélange, les cellules marquées, ou non, par les billes magnétiques arrivent dans la partie du laboratoire sur puce dédiée à la séparation magnétique.
Phase de séparation magnétique
Cette deuxième zone est dédiée à la séparation des cellules marquées des autres constituants de l’échantillon par attraction magnétique des complexes [billes + cellule] sur des bobines placées au fond des canalisations (separation stage). L’activation des microbobines intégrées permet la déviation des complexes monocytes/microbilles dans la canalisation inférieure et leur séparation du milieu initial. Grâce à la structure tridimensionnelle du capteur, cette étape est effectuée en mode continu ou en mode « batch », comme illustré ci-dessous.
Le tri magnétique a été mis au point et validé, dans un premier temps, à l’aide de billes magnétiques de différents diamètres. Les essais réalisés sur des échantillons cellulaires pour différentes tailles de billes magnétiques fonctionnalisées ont montré que la séparation la plus efficace se faisait pour des billes de 2,8 µm (meilleurs taux de marquage). L’efficacité de cette méthode de tri a été évaluée en utilisant des échantillons dont le rapport MOsains/MOinfllammatoires a été préalablement déterminé grâce à l’utilisation de cellules de Malassez. Les complexes alors séparés des autres types cellulaires sont entraînés par écoulement vers les électrodes fonctionnalisées.
Phase de détection
La première fonction de ce module est de piéger sélectivement sur la surface des électrodes de comptage les monocytes inflammatoires. Deux verrous principaux sont liés à cette fonction. Le premier est que le piégeage doit être le plus efficace possible, les monocytes inflammatoires pouvant être présents en faible quantité, le second étant que le piégeage doit être le plus sélectif possible de manière à minimiser les risques de faux diagnostic. Ces verrous peuvent être levés en intégrant un actionneur magnétique (microbobines) qui va permettre d’amener les complexes MO/microbilles au plus près des électrodes et d’accroitre les probabilités de couplage (Brevet N° 13 57410) ; après fixation, les microbobines sont désactivées, libérant les MO sains dans la canalisation fluidique. Ne resteront donc sur les électrodes fonctionnalisées que les MO inflammatoires. Le dimensionnement des électrodes est une étape très importante afin de garantir le piégeage de toutes les cellules inflammatoires, compte tenu du fait que l’attraction magnétique opère de manière équivalente sur les MO inflammatoires et sains.
Le comptage des cellules est réalisé par spectroscopie d’impédance électrochimique. En mesurant l’impédance à l’interface cellule/électrode pour une large gamme de fréquences il est possible, de relier la variation d’impédance au taux de recouvrement et donc au nombre de cellules piégées.
Objectifs de la thèse
Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de développer le second module microfluidique de tri et comptage cellulaire, le but étant de se rapprocher de la détection de la cellule unique. Ces travaux de thèse s’appuient sur les premiers essais réalisés en mode statique et fluidique sur des macro-électrodes lors de la thèse d’Armelle Montrose23. Ces travaux ont nécessité la conception et la réalisation des systèmes de microélectrodes, leur intégration dans un réseau de microcanaux, la mise au point du procédé de fonctionnalisation en microfluidique et la validation du concept à partir de systèmes cellulaires exprimant (ou non) les antigènes CD14 et/ou CD16 (tests de sensibilité et de sélectivité). Par ailleurs, dans un second temps la possibilité d’utiliser ces puces microfluidiques pour la caractérisation d’interactions récepteur-ligand sur cellule entière a également été testée.
Influence de la taille des microélectrodes
En utilisant la spectroscopie d’impédance électrochimique comme méthode d’analyse, chaque géométrie d’électrode va posséder une réponse impédimétrique différente suivant le nombre de cellules adhérentes à sa surface. Ces géométries sont caractérisées par une certaine limite de détection et un rapport signal sur bruit. Les mesures d’impédance vont permettre de caractériser les propriétés résistives et capacitives de chaque système. Comme les cellules se fixent à la surface du biocapteur, les parties réelle et imaginaire de l’impédance varient, conduisant à des variations de la capacitance interfaciale, de la conductance moyenne ou de la capacitance moyenne. En général, pour toutes les géométries d’électrodes, la variation d’impédance est inversement proportionnelle à la surface active24. Cette propriété a été démontrée lors du piégeage de THP-1 sur des macroélectrodes d’or de 1 à 0,04 cm² (thèse A. Montrose) (Figure II-5). Dans la région des hautes fréquences, les paramètres d’impédance sont plus ou moins insensibles à la surface d’électrode active, mais très sensibles dans la région des basses fréquences. De plus, il est observé un saut de l’angle de phase dans la région des hautes fréquences lorsque l’aire de l’électrode de travail augmente, et aux basses fréquences lorsque celle-ci diminue. La résistance au transfert de charge et la capacitance diminuant avec l’augmentation de l’aire de l’électrode, il y a donc un réel intérêt à miniaturiser encore plus les électrodes, afin d’augmenter la sensibilité de détection. Pour cela, les apports des technologies de salle blanche, tels que la photolithographie ou encore le « lift-off », sont très importants. Les procédés de fabrication mis en œuvre pour la miniaturisation de l’électrode de travail et de la contre-électrode seront présentés dans le chapitre 3 au fil des expériences.
Bio fonctionnalisation des microélectrodes
Le succès du dispositif de comptage et d’analyse par impédance repose sur la capacité des cellules à être piégées spécifiquement à la surface des microélectrodes afin de limiter une éventuelle perte de signal électrique due aux courants de fuites entre l’électrode et l’électrolyte et ainsi d’améliorer la sensibilité de détection. Ainsi, les mécanismes régissant la fixation des cellules sont d’une importance significative.
Le piégeage est réalisé par l’intermédiaire d’électrodes fonctionnalisées à l’aide d’anticorps particuliers (anti-CD14 ou anti-CD16) capables de reconnaître avec une extrême spécificité l’antigène correspondant présent sur la cellule que l’on souhaite piéger (monocyte ou monocytes pro-inflammatoire). Les premiers essais réalisés sur macroélectrodes ont démontré que les anticorps pouvaient être greffés par l’intermédiaire d’un système multicouche comprenant des couches auto-assemblées (SAM pour self assembled monolayer) de thiols mixtes, c’est-à-dire de thiols présentant différents groupements terminaux (dont un groupement fonctionnel, COOH) et ayant des longueurs de chaîne très différentes (Figure II-6). L’utilisation de thiols mixtes permet :
– d’augmenter la densité des chaînes et ainsi éviter les adsorptions non spécifiques avec l’or ;
– de diluer le nombre de groupements fonctionnels et ainsi d’éviter les adsorptions non spécifiques qui pourraient se produire au niveau de la SAM ;
– de prévenir la dénaturation de la biomolécule qui serait due à un trop grand nombre de liaisons entre la surface de thiols et la molécule
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Table des matières
Chapitre 1 : Impédance et analyses cellulaires
1. Introduction
2. La spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE)
2.1. Généralités sur l’impédance
2.2. Principe de la méthode de Spectroscopie d’Impédance Electrochimique
2.3. Effets d’interfaces électrode/électrolyte
2.3.1. Chute ohmique
2.3.2. La capacité de double couche
2.3.3. Processus Faradique
2.3.4. Diffusion des espèces à l’électrode
2.4. Exploitation des résultats : schémas électriques équivalents
2.5. Représentation en SIE
2.5.1. Diagramme de Bode
2.5.2. Diagramme de Nyquist
3. Applications de l’impédance à l’analyse des cellules
3.1. Analyses collectives
3.1.1. Différenciation cellulaire
3.1.2. Mesure d’adhérence
3.1.3. Cytotoxicité et criblage de substances bioactives
3.2. Analyse individuelle
3.2.1. Comptage individuel type Coulter
3.2.2. Analyse de la cellule unique
3.3. Microscopie par mesure d’impédance électrochimique
3.4. Un dispositif impédimétrique commercial, le capteur multiparamétrique, Bionas 2500®
4. Systèmes impédimétriques microfluidiques
4.1. Choix des matériaux
4.2. Caractéristiques de l’écoulement
4.3. Exemples de réalisation de dispositifs microfluidiques impédimétriques
5. Conclusion
Chapitre 2 : Descriptif du projet
1. Introduction
2. Présentation générale du laboratoire sur puce
2.1. Principe général
2.2. Choix des cellules
2.3. Description du dispositif développé
2.3.1. Phase de marquage
2.3.2. Phase de séparation magnétique
2.3.3. Phase de détection
3. Objectifs de la thèse
3.1. Influence de la taille des microélectrodes
3.2. Bio fonctionnalisation des microélectrodes
3.3. Matériels et Méthodes d’analyses
4. Conclusion
Bibliographie
Chapitre 3 : Etudes de la sensibilité des microélectrodes
1. Introduction
2. Première génération de dispositif
2.1. Technologie de microfabrication
2.1.1. Préparation du substrat
2.1.2. Photolithographie et structuration des électrodes d’or
2.1.3. Métallisation
2.1.4. Réalisation des canalisations en PDMS
2.2. Qualification en mode statique
2.3. Qualification en mode fluidique
3. Seconde génération de dispositif
3.1. Technologie de microfabrication
3.2. Qualification en mode statique
3.2.1. Tests de spécificité
3.2.2. Fonctionnalisation et piégeage cellulaire
3.3. Qualification en mode fluidique
3.3.1. Modifications technologiques de microfabrication
3.3.2. Tests de fonctionnalisation de la SU8
3.3.3. Fonctionnalisation des microélectrodes
3.3.4. Piégeage cellulaire
4. Optimisation du design des microélectrodes Interdigitées
4.1. Variation de l’espace inter-électrode
4.2. Influence du nombre de brins
4.2.1. Modifications technologiques
4.2.2. Piégeage cellulaire
5. Conclusion
Bibliographie
Chapitre 4 : Application à l’étude d’interactions récepteurs / ligands
1. Introduction
2. Choix du système étudié
3. Fonctionnalisation des microélectrodes
3.1. Etudes préliminaires sur macroélectrodes
3.2. Transposition aux microélectrodes
4. Les interactions Ligands – Récepteurs A2a
4.1. Mesures d’impédance en mode faradique
4.1.1. Interactions avec cellules présentant le récepteur A2a
4.1.2. Cas des cellules n’exprimant pas le récepteur A2a
3.1.3. Analyse de mélanges
4.2. Mesures d’impédance en mode non faradique.
5. Compétition d’interactions au récepteur A2a entre le c-di-AMP et des molécules libres
5.1. Cas du ZM 241385
5.2. Cas du CGS 21680
6. Discussions
Bibliographie
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