Purification des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs)

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Bilan des types d’anticorps sur le marché

Depuis 1986 et la mise sur le marché du premier anticorps monoclonal thérapeutique le Muromonab, 35 anticorps monoclonaux thérapeutiques et 6 protéines de fusion-Fc (ou immunoadhésines, dérivés d’anticorps (paragraphe 26. Les différents formats d’anticorps monoclonaux thérapeutiques, Introduction) ont étépprouvésa pour un usage clinique, par une ou plusieurs agences mondiales de santé publique régulant la commercialisation des médicaments (la FDA pour Food and Drug Administration aux USA, l’EMA pour European Medicines Agency en Europe, la SDFA pour China’s State Food and Drug Administration en Chine) (Beck et al., 2009), (Jiang et al., 2011).

Les anticorps sont principalement préconisés pour lutter contre les cancers (17 anticorps approuvés) et les pathologies immunologiques et inflammatoires (16 anticorps approuvés, dont un retrait le Raptiva ou Efalizumab). D’autre part, des anticorps thérapeutiques sont également disponibles pour la ransplantation (Muromonab, Daclizumab, Belatacept), l’infectiologie (Palivizumab), la médecine cardiovasculaire (Abciximab), l’ophtamologie (Ranibizumab) et le traitement de maladies rares, voire orphelines, pour lesquelles peu de traitements efficaces sont disponibles (Natalizumab pour la sclérose en plaque, Toclizumab pour la maladie de Castelman). Dans le futur, de nouveaux anticorps ciblant des pathologies comme le diabète de type I ou la maladie d’Alzheimer seront mis à disposition. En effet, 4 nouveaux anticorps sont en cours d’étude clinique de phase III (l’otélixizumab et le téplizumab pour le diabète,el bapineuzumab et le solanézumab pour la maladie d’Alzheimer) en 2012.

Bilan économique des anticorps sur le marché

Les anticorps monoclonaux thérapeutiques font partis des biomédicaments ou produits biopharmaceutiques. Les biomédicaments connaissent un succès croissant depuis les années

70. L’insuline, l’érythropoétine, l’hormone de croissance et maintenant les anticorps monoclonaux sont les plus connus des biomédicaments. Depuis dix ans, la proportion des anticorps thérapeutiques dans le marché des biomédicaments ne cesse d’augmenter pour atteindre près de 50% en 2010. Ils représentent unmarché estimé à plus de 50 milliards de dollars, ce qui correspond à environ 6% du marché total des produits pharmaceutiques en 2010. Parmi la quarantaine d’anticorps et dérivéesapprouvés pour un usage thérapeutique, 6 génèrent plus de 90% des ventes : l’étanercept-EnbrelTM (7,3 Md $),le bevacizumab-Avastin® (7 Md $), le rituximab-Rituxan® (6,9 Md $), l’adalimumab (6,5 Md $), l’infliximab (6,5 Md $) et le trastuzumab-Herceptin® (5,9 Md $). Ces 6 biomolécules se situent d’ailleurs dans les 15 produits pharmaceutiques les plus vendus en 2010 et correspondent aux meilleures ventes dans leurs indications respectives, à savoir l’oncol ogie et l’inflammation.

Les retombées économiques importantes générées parles anticorps thérapeutiques ont permis aux grands groupes pharmaceutiques d’investir dans la recherche et d’acquérir des compagnies de biotechnologie spécialisées dans le développement de nouveaux formats d’anticorps qui pourraient révolutionner le traitement de certaines pathologies, comme le cancer, dans les années à venir. On estime qu’en 2014, la moitié des 100 molécules les plus vendues seront des biomolécules, dont une part importante sera constituée par les anticorps monoclonaux ou dérivés (Strohl, 2009). En effet, unnombre important de biomolécules ou d’anticorps monoclonaux entrent en essai clinique. Depuis 2007, environ 40 nouveaux anticorps monoclonaux entrent chaque année en phase clinique et on compte actuellement près de 300 nouveaux anticorps et une vingtaine d’immunoadhésines en cours d’essais (phase I, II ou III) (Reichert, 2011).

Les différents formats d’anticorps monoclonaux thérapeutiques

Il existe une grande diversité de format d’anticorps en fonction du mode d’action thérapeutique de l’anticorps. Aujourd’hui sur le marché, la majorité des anticorps utilisés en clinique sont des immunoglobulines entières de type IgG1. Il existe tout de même quelques IgG2 (Panitumumab, Denosumab), IgG4 (Natalizumab). Les fragments d’anticorps Fab sont présents (4) et des anticorps conjugués à des toxines, radionucléides ou à du polyéthylèneglycol (PEG) sont également utilisés. nUnouveau type d’anticorps est en plein essor : les immunoadhésines. Ils représentent 7 anticorps présents sur le marché et 4 en phase III. Les immunoadhésines résultent de l’associationde domaines fonctionnels d’une protéine (site de liaison d’un récepteur, d’un ligand) et du fragment Fc d’un anticorps (Capon et al., 1989). De plus, il existe en développement (essaiscliniques de phase II (Wurch et al., 2009)) un autre format d’anticorps, les dAb pour « single domain antibody », qui sont des fragments d’anticorps à domaine unique (Chames and Baty, 2009 b). Ils sont exprimés naturellement chez les camélidés (lamas, chameaux), et certainesespèces de requin (Figure 11). L’avantage de telles molécules découle de leur petite taille out en conservant une grande affinité pour leur cible. Ces molécules peuvent être utilisées ulesse comme petites molécules thérapeutiques, par exemple en cancérologie pour pénétrer plus facilement les tumeurs solides (Behar et al., 2009), ou comme base pour élaborer des molécules plus complexes. Un autre format correspond au anticorps bispécifiques dirigés contre des épitopes différents, étendant ainsi la fonction de l’anticorps classique (Chames and Baty, 2009a). D’autre part, un format atypique d’anticorps existe. Le Catumaxomab, une IgG2 hybride rat/souris, présente la particularité d’être le seul anticorps bispécifique(anti-CD3 et anti EpCAM) sur le marché. De façon analogue, on pourrait imaginer des fragments d’anticorps tri- ou tétra-valents, scFv ou diabodies qui pourraient faire partie de la prochaine génération de « molécules dérivées d’anticorps » (Dutertre and Teillaud, 2006).

Cibles et mode d’action des anticorps

Les anticorps utilisés à des fins thérapeutiques peuvent exercer différents modes d’action selon la cible et la pathologie à traiter (Figure 14). Le choix de la molécule cible est majeur puisque cela définit l’efficacité de l’anticorps et les effets secondaires qu’il pourrait entraîner.

Les cibles des anticorps peuvent être classées en deux types :

1) antigènes solubles

2) antigènes membranaires Selon la cible, le mode d’action varie.

Les anticorps neutralisant un antigène soluble

La fixation d’un anticorps neutralisant a pour effet de bloquer l’activité biologique de l’antigène sur sa cible. Ainsi l’inhibition de la liaison de l’antigène (toxines, cytokines, chimiokines, ….) sur son récepteur spécifique va bl oquer la voie de signalisation normalement induite. Ces anticorps neutralisants représentent un peu moins d’un tiers des anticorps sur le marché. Les molécules ciblées sontprincipalement des cytokines comme le TNF4 (Tumor Necrosis Factor 4) ou des interleukines (IL-12/IL-23, IL-1, IL-6). On retrouve également un composant du complément (C5) et des facteurs de croissance (VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), et EGFR (Epidermal Growth Factor). Les anticorps monoclonaux ciblant les toxines ne sont pas encore présents sur le marché mais en cours de développement. En ce qui concerne la neutralisation de virus, les anticorps agissent de la même façon en se fixant à la protéine d’enveloppe responsable de la liaison de la particule virale à sa cible cellulaire, bloquant ainsi son ent rée et l’infection de la cellule (Abès et al., 2009). Les anticorps peuvent également immobiliser et agglutiner les agents infectieux, et favoriser l’opsonisation et leur destruction (phagocytose, ADCC et CDC).

Les anticorps liant un antigène membranaire

Les antigènes liant un antigène membranaire représentent la plupart des anticorps monoclonaux ayant reçu une AMM ou en développement. Dans ce cas, l’anticorps se lie à l’antigène présent à la surface de la cellule cible, et peut déclencher un large type d’effets (Figure 12). Les effets directs peuvent conduire à la mort cellulaire (apoptose), l’activation ou l’inhibition de voies de signalisation telles que l’activation de la production de cytokines, la différenciation, la migration cellulaire ou le blocage de récepteurs membranaires. D’autres effets, cette fois-ci indirects, peuvent induire une cytotoxicité, passant par l’activation des fonctions effectrices de l’anticorps qui recrute alors des effecteurs cellulaires (ADCC) ou moléculaires (CDC) (Abès et al., 2009). Les ciblesmembranaires des anticorps peuvent être des récepteurs de facteurs de croissance (EGF-R, HER-2) ou de cytokines (CD25), des molécules d’adhérence impliquées dans les interactions cellulaires (Ep-CAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), intégrine VLA-4, LFA-1 (Leukocyte Fonction Associated Antigen), molécule CD11a) ou des protéines transmembranaires(CD20, CD33, CAMPATH-1/CD52). Les nouvelles cibles en cours d’évaluation sont essentiellement des récepteurs ou des molécules impliquées dans le contrôle de l’activation cellulaire.

Limitations des anticorps thérapeutiques

Il existe des limitations importantes qui freinent l’utilisation massive des anticorps en clinique. Parmi ces limitations, la principale est celle du coût excessif des traitements et dans des cas plus rares, la survenue d’effets indésirables graves.

Les systèmes de production des anticorps et leur coût

Les anticorps sont produits en cellules eucaryotes à cause de leur forme multimérique ou des glycosylations post-traductionnelles qu’ils subissent. La plupart des anticorps thérapeutiques sont produits par des cellules mammaliennes de type CHO (issues d’ovaires de hamster chinois), NS0 ou SP2/0 (deux lignées de myélome murin) (Cochet and Chartrain, 2009). Des nouveautés dans les milieux de culture, dans les vecteurs d’expression et dans les lignées cellulaires utilisés ont permis d’améliorerle rendement de production en anticorps. Par exemple, des lignées cellulaires optimisées sont capables de produire plusieurs grammes d’anticorps par litre de milieu de culture contre quelques milligrammes avant optimisation (Cochet and Chartrain, 2009). 200 millions d’euros d’investissement pour 200 kg d’anticorps par an (Olivier and Mehtali, 2009) sont nécessaires pour produire des anticorps dans ces systèmes.

D’autre part, les anticorps utilisés en thérapie sont très coûteux (nombreuses injections et doses) et représentent plusieurs milliers d’euros (de 1000 à 5000) par mois et par patient (Olivier and Mehtali, 2009). Par exemple, les patients traités avec le Rituximab reçoivent de 8 à 16 doses d’anticorps correspondant à 6 ou 12 g de Rituximab par patient (O’Brien et al., 2001). Des procédés de production coûteux superposé au coût thérapeutique mènent à développer de nouveaux systèmes de production pluséconomes. Ainsi, des levures (Pichia Pastoris), des champignons filamenteux (Aspergillus niger) (Ward et al., 2004), des cellules d’insectes (Edelman et al., 1997), des cellules aviaires (Olivier et al., 2010), des organismes transgéniques végétaux (feuilles de tabac) (Lai etal ., 2010), ou des animaux (souris) (Tang et al., 2008) ont été utilisés pour produire à moindrecoût des anticorps thérapeutiques. Le système bactérien, le système de production le moinscoûteux, n’est pas adapté à la production d’anticorps entiers qui sont des protéines trop complexes. Cependant, il a été envisagé la production de petits fragments d’anticorps de type scFv par des bactéries (Arbabi-Ghahroudi et al., 2005). La découverte des anticorps de camélidés dont la partie variable n’est composée que d’une chaîne lourde, a relancé l’intérêt pour ce système de production (Harmsen and De Haard, 2007). En effet, ce petit fragment variable de 12 kDa, nommée sDAb (single domain antibody) ou VHH, est facilement produit en bactéries avec de très bons rendements. D’ailleurs, la société Ablynx produit te exploite commercialement ce type de fragments d’anticorps (les nanobodies), dont certains sont en cours d’évaluation clinique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde ou du cancer.

La recherche dans le domaine de la production des protéines thérapeutiques est très active et de nombreux systèmes de production alternatifs aux cellules mammaliennes sont en cours d’étude. Dans un avenir proche, de nouvelles plateformes de production d’anticorps monoclonaux devraient être approuvées et permettreune baisse progressive des coûts tout en améliorant les propriétés cliniques de ces agentshérapeutiques (Olivier and Mehtali, 2009). De plus, l’émergence du concept d’anticorps « biosimilaires », à la manière des versions génériques des petites molécules chimiques, devraitégalement contribuer à la baisse du prix des traitements (Reichert et al., 2009). Les biosimilaires sont « des nouvelles versions similaires au produit biologique de référence en termes de qualité, d’efficacité et de sécurité ». Ce sont des formes génériques des molécules dont lebrevet a expiré.

Effets indésirables

Les anticorps possèdent un taux d’approbation de 20%. Ce taux est plus élevé que pour les petites molécules chimiques, d’environ 5% (Reichert et al., 2005). Ceci s’explique par les caractéristiques propres des anticorps : grande spécificité pour leur cible, longue demi-vie et une bonne tolérance générale chez l’homme. ependantC chez les patients traités, les anticorps thérapeutiques ne sont pas sans effet toxique, effets qui peuvent parfois être très graves et difficiles à prévoir.

Ces effets toxiques sont regroupés en cinq catégories : les infections opportunistes, le syndrome cytokinique, les pathologies autoimmunes, la toxicité d’organe et l’immunogénicité (Pallardy,2009).

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Table des matières

INTRODUCTION
1 Définition, structure et synthèse des anticorps
1.1 Définition d’un anticorps
1.2 Structure d’un anticorps
1.2.1 Structure générale
1.2.2 Structure détaillée
1.3 Classes d’anticorps
1.3.1 Classes et sous classes d’immunoglobulines
1.3.2 Répartition et fonction des immunoglobulines
1.4 Organisation et réarrangements des gènes codant les immunoglobulines
1.4.1 Les gènes codant pour les Igs
1.4.2 Réarrangements des gènes
1.5 Expression du BCR et sélection des lymphocytes B dans la moelle osseuse
1.6 Modifications post-traductionnelles des anticorps : les glycosylations
2 Fonction biologique des anticorps
2.1 Fonction de reconnaissance : liaison à l’antigène
2.2 Fonctions effectrices : la cytotoxicité liée à l’anticorps
2.2.1 Cytotoxicité dépendante des cellules de l’immunité (ADCC)
2.2.2 Cytotoxicité dépendante du complément (CDC)
3 Caractéristiques pharmacodynamiques et pharmacocinétiques des anticorps
3.1 Affinité/Avidité
3.2 Demi-vie et biodistribution
4 Principales techniques de production des anticorps et leur utilisation
4.1 Anticorps polyclonaux
4.2 Anticorps monoclonaux murins
4.3 Anticorps monoclonaux de lapin
4.4 Les diverses utilisations des anticorps
4.4.1 Anticorps utilisés en diagnostic
4.4.2 Anticorps utilisés en thérapie
5 Les types d’anticorps thérapeutiques
5.1 Les anticorps chimériques
5.2 Les anticorps humanisés
5.3 Les anticorps totalement humains
5.3.1 Le Phage display
5.3.2 Les souris transgéniques
5.3.3 L’utilisation des lymphocytes B humains
5.4 Les anticorps optimisés
5.4.1 Amélioration des propriétés de fixation à l’antigène
5.4.2 Amélioration des propriétés effectrices
5.4.3 Amélioration de la demi-vie
6 Les anticorps thérapeutiques sur le marché
6.1 Les différents anticorps monoclonaux sur le marché en 2012
6.1.1 Bilan des types d’anticorps sur le marché
6.1.2 Bilan économique des anticorps sur le marché
6.2 Les différents formats d’anticorps monoclonaux thérapeutiques
6.3 Cibles et mode d’action des anticorps
6.3.1 Les anticorps neutralisant un antigène soluble
6.3.2 Les anticorps liant un antigène membranaire
6.4 Limitations des anticorps thérapeutiques
6.4.1 Les systèmes de production des anticorps et leur coût
6.4.2 Effets indésirables
OBJECTIFS DES TRAVAUX DE THESE
MATERIELS ET METHODES
1 Matériels utilisés
1.1 Peptide N-terminal de la BoNT/A : TBA-Nter (2 kDa)
1.2 Entérotoxine B de Staphyloccocus aureus (SEB)
1.3 Tat, ses dérivés et les protéines de fusion ZZTat101
1.3.1 Tat et peptides Tat
1.3.2 Les protéines de fusion ZZTat101
2 Culture cellulaire
2.1 Comptage des cellules
2.2 Culture des différentes souches
2.3 Conservation des cellules
2.3.1 Congélation à -196°C
2.3.2 Décongélation à -196°C
3 Purification des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs)
3.1 Origine du matériel
3.2 Purification des PBMCs
4 Préparation des cellules
4.1 Tampon utilisé
4.2 Préparation des Monocytes
4.2.1 Purification des monocytes
4.2.2 Contrôle de la pureté des monocytes
4.2.3 Mise en culture des monocytes
4.3 Elimination des Natural Killer de la fraction négative en monocytes
4.3.1 Elimination des NK
4.3.2 Contrôle de l’élimination des NK
4.3.3 Mise en culture
4.4 Lymphocytes B
4.4.1 Purification des lymphocytes B
4.4.2 Contrôle de la pureté en lymphocytes B
4.4.3 Mise en culture
4.5 Elimination des Natural Killer à partir des PBMCs
4.5.1 Elimination des NK
4.5.2 Contrôle de l’élimination des NK
4.5.3 Mise en culture
4.6 Lymphocytes B mémoires
4.6.1 Purification des lymphocytes B mémoires
4.6.2 Mise en culture
5 Immunisation in vitro
5.1 Immunisation in vitro contre le peptide N-terminal de la toxine botulinique A (BoNT/A): TBA-Nter
5.1.1 Coculture Cellules dendritiques/PBMCs dépourvues de monocytes et de NK
5.1.2 Utilisation de PBMCs après élimination des cellules « Natural Killer »
5.2 Immunisation in vitro contre la protéine Tat101 du virus VIH-1
5.2.1 Rôle des composants de ZZTat101 : immunisation in vitro par ZZTat101, ZZ et Tat101
5.2.2 Mécanisme d’action de ZZTat101 : immunisation in vitro par ZZTat101 et plusieurs formes mutantes
5.3 Cytométrie en flux
5.3.1 Tampon utilisé
5.3.2 Principe
5.3.3 Marquage
6 Immortalisation
6.1 Production des virus Epstein-Barr (EBV)
6.2 Test qualité des Transfokits utilisés
6.3 Immortalisation des cellules par les virus EBV (Transfokit)
6.4 Culture des lignées immortalisées
7 Fusion
7.1 Les préparations préliminaires à la fusion
7.1.1 Préparation des cellules nourricières
7.2 Obtention d’hybridomes sécrétant les anticorps spécifiques à partir des cellules immortalisées par EBV
7.3 Obtention des hybridomes sécrétant les anticorps spécifiques à partir de lymphocytes B sanguins
7.4 Obtention des hybridomes sécrétant les anticorps spécifiques à partir des cellules issus de l’immunisation in vitro
8 Les dosages immunologiques
8.1 Les préparations préliminaires au dosage
8.1.1 Les tampons utilisés
8.1.2 Anticorps utilisés
8.1.3 Préparation des traceurs couplés à l’AChE
8.1.4 Mesure de l’activité AChE
8.1.5 Adsorption passive sur plaques de microtitration
8.1.6 Couplage de protéines à la biotine
8.2 Les dosages immunologiques utilisant la BoNT/A
8.2.1 Dosage ELISA des plasmas de donneurs de sang
8.2.2 Criblage des anticorps monoclonaux produits dans les surnageants de culture des immunisations in vitro et des hybridomes
8.3 Les dosages immunologiques utilisant la SEB
8.3.1 Dosage des IgGs anti-SEB dans les plasmas
8.3.2 Criblage des anticorps monoclonaux produits dans les surnageants de culture des immortalisations et des hybridomes
8.4 Les dosages immunologiques des anticorps anti-Tat101
8.4.1 Dosage ELISA des plasmas de donneurs de sang
8.4.2 Criblage des anticorps monoclonaux produits dans les surnageants de culture des immunisations in vitro et des hybridomes
1ère Partie : PRODUCTION D’ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS A PARTIR DE LYMPHOCYTES B HUMAINS DE DONNEURS INFECTES OU VACCINES PAR IMMORTALISATION VIRALE ET FUSION CELLULAIRE
INTRODUCTION
1 Production d’anticorps par les lymphocytes B humains
1.1 Le virus d’Epstein-Barr
1.2 Les lymphocytes B mémoires
2 Modèle d’étude : Entérotoxine B de Staphylococcus aureus (SEB)
2.1 Staphylococcus aureus
2.1.1 Classification des entérotoxines staphylococciques (SEs)
2.1.2 Mode d’action des entérotoxines staphylococciques (SEs)
2.2 Entérotoxine B de Staphylococcus aureus
2.2.1 Structure
2.2.2 Voies d’expositions, toxicité et effet sur la santé
2.2.3 Mode d’action
2.2.4 Activité émétique
2.2.5 Mise en évidence de la toxine SEB
2.2.6 La SEB en tant qu’arme biologique
RESULTATS ET DISCUSSION
1 Méthodologie utilisée
2 Sélection des donneurs sanguins et des lymphocytes B mémoires sécréteurs d’IgGs anti-SEB
2.1 Sélection du donneur de sang
2.2 Purification des lymphocytes B mémoires du donneur 1
3 Immortalisation des lymphocytes B mémoires par le virus Epstein-Barr (EBV)
3.1 Test de la qualité de production des virus EBV
3.2 Immortalisation des lymphocytes B mémoires sécréteurs d’IgGs anti-SEB
4 Fusion des lymphocytes B mémoires immortalisés par le virus Epstein-Barr (EBV)
4.1 Décongélation des puits immortalisés
4.2 Préparation de la fusion
4.2.1 Mise au point de la concentration d’ouabaïne
4.2.2 Vérification de l’absence d’effet de l’Hypoxantine Aminoptérine Thymidine (HAT) sur les lymphocytes B immortalisés
4.2.3 Vérification de la mortalité des myélomes sous HAT et ouabaïne
4.3 Fusion des LB immortalisés par EBV (puits 2B5) avec différents myélomes
4.4 Fusion des lymphocytes B sanguins avec l’hétéromyélome HM
4.5 Décongélation des trois puits d’immortalisation 1C2, 2C10, 1E3
4.6 Fusion des puits d’immortalisation 1C2, 2C10 avec HM
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
2ème Partie : PRODUCTION D’ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS A PARTIR DE LYMPHOCYTES B HUMAINS DE DONNEURS NAIFS PAR IMMUNISATION IN VITRO
1 La réponse anticorps in vivo
1.1 La réponse anticorps T-dépendante
1.2 La réponse anticorps T-indépendante
2 L’immunisation in vitro
PREMIER MODELE D’ETUDE
Clostridium botulinum A (BoNT/A)
Mise en place du protocole d’immunisation in vitro
INTRODUCTION
1 Clostridium botulinum et ses toxines
1.1 Clostridium botulinum
1.2 Les toxines botuliques produites par Clostridium botulinum
1.2.1 Les différents types
1.2.2 Leur synthèse
1.2.3 Mode d’action des toxines botuliques
1.3 Les différents modes de contamination des toxines botuliques
1.4 Les symptômes de l’intoxication
1.5 Diagnostic
1.6 Traitements contre le botulisme
1.7 Les différentes utilisations des toxines botuliques
1.7.1 Un outil thérapeutique
1.7.2 Une arme potentielle du bioterrorisme
RESULTATS ET DISCUSSION
1 Vérification de l’absence d’anticorps anti-TBA-Nter dans le plasma du donneur utilisé
2 Mise au point d’un protocole d’immunisation in vitro efficace contre la TBA-Nter : comparaison de deux protocoles
2.1 Protocole 1 : Elimination des lymphocytes Natural Killer (NK) et activation par des cytokines et l’antigène
2.1.1 Méthodologie utilisée
2.1.2 Vérification de l’élimination des NK, de la présence lymphocytes B, T et monocytes et mesure de l’activation de la réponse immunitaire
2.1.3 Dosages des anticorps anti-TBA-Nter
2.2 Protocole 2 : Activation séparée des monocytes et des lymphocytes
2.2.1 Méthodologie utilisée
2.2.2 Vérification de la présence des lymphocytes B et T et de la maturation des monocytes en cellules dendritiques
2.2.3 Dosage des anticorps anti-TBA-Nter
2.3 Immortalisation
3 Production d’anticorps monoclonaux humains anti-TBA-Nter à partir du protocole comportant l’élimination des NK
3.1 Vérification de l’absence d’anticorps anti-TBA-Nter dans le plasma du pool de 5 donneurs utilisé
3.2 Vérification de l’absence des cellules NK, de la présence lymphocytes B, T et monocytes et mesure de l’activation de la réponse immunitaire
3.3 Dosage des anticorps anti-TBA-Nter
3.4 Immortalisation et fusion
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
DEUXIEME MODELE D’ETUDE
La protéine transactivatrice Tat du virus de l’immunodéficience humaine type 1 (VIH-1)
INTRODUCTION
1 La protéine transactivatrice Tat du virus de l’immunodéficience humaine type 1 (VIH- 1)
1.1 Rôle de Tat dans l’infection au VIH-1
1.2 Structure et organisation de Tat
1.3 Propriété autoadjuvante de Tat
RESULTATS ET DISCUSSION
1 Vérification de l’absence d’anticorps anti-Tat dans le plasma des pools de donneurs utilisé
2 Vérification de l’élimination des lymphocytes NK et de la pureté des lymphocytes B utilisés pour l’immunisation in vitro
3 Expérience préliminaire : vérification du système d’immunisation in vitro sur ZZTat101.
4 Immunisation in vitro avec ZZTat, ZZ, Tat ou un mélange ZZ+Tat
5 Détermination de la région de ZZTat impliqué dans la réponse humorale in vitro
5.1 Rôle de la liaison avec les héparanes sulfates
5.2 Rôle des cystéines
6 Production d’anticorps anti-Tat par immortalisation avec un partenaire cellulaire HM
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
ARTICLE
CONCLUSION GENERALE
BIBLIOGRAPHIE