Préparation et conservation du matériel végétal

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UTILISATIONS DES Albizia ETRANGERES

UTILISATIONS TRADITIONNELLES

Ces espèces, utilisées traditionnellement comme bois de chauffage, de construction ou autres, sont connues aussi pour leurs pouvoirs thérapeutiques. L’utilisation peut être différente et varier d’un pays à l’autre :
– A. anthelmintica : Il a été montré lors des études au Kenya que cette plante est efficace pour le traitement de l’helminthose intestinale et des nématodes chez l’homme et le bétail (GATHUMA et al., 2004 ; MUTHEE et al., 2011).
– A. glaberrima : En Afrique de l’Est, cette plante est utilisée contre plusieurs maladies dont la fièvre, la douleur, l’épilepsie et les troubles du système nerveux (ADEBESSIN et al., 2015).
– En Inde, plusieurs maladies, à savoir les maladies cardiovasculaires et les maladies coronariennes, sont traitées avec de l’écorce d’A. amara (GUNDAMARAJU et al., 2014). Cette même plante peut être utilisée pour traiter les ulcères. Son fruit est antipaludique et antitussif (ORWA et al., 2009).
– En Chine, A. julibrissin est utilisée pour traiter l’insomnie. Elle est aussi un anti-tumoral (QIAN et al., 2017). Il a été montré que les Chinois utilisent la plante pour le traitement de l’anxiété (LIU et al., 2017).
– A. odoratissima : Cette plante est utilisée traditionnellement en Inde pour le traitement des ulcères, de l’asthme et la lèpre (BANOTHU et al., 2017).
– Au Cameroun, A. adianthifolia est utilisée pour soigner plusieurs maladies comme les maladies infectieuses et associées (TAMOKOU et al., 2012).
– A. schimperiana est utilisée traditionnellement au Kenya pour le traitement des infections parasitaires et bactériennes telles que le paludisme et la pneumonie (SAMOYLENKO
et al., 2009).
– A. zygia : Il a été montré qu’au Ghana, cette plante est utilisée pour soigner les troubles inflammatoires, la douleur et la fièvre et même pour traiter le paludisme. (ABOTSI et al., 2017).

DONNEES PHARMACOLOGIQUES ET CONSTITUANTS ISOLES DE QUELQUES ESPECES D’Albizia

– Des études in vitro ont montré que les racines et les feuilles d’A. antunesiana possèdent un pouvoir antioxydant puissant. Des composés phénoliques aromatiques tels que des coumarines et des tritérpenoides, ont été révélés des extraits de la plante (CHIPI et al., 2013). De même, les extraits aqueux et éthanolique des feuilles et des racines auraient une activité hypoglycémiante en inhibant l’α-amylase et l’α-glucosidase. (CHIPITI et al., 2015)
– A. adiantifolia : Trois saponines triterpénoiques (les adiantifoliosides) ont été isolées chez A. adiantifolia. Ces derniers auraient un effet apoptotique des cellules cancéreuses épidermoïdes humaines (A431) (NOTE et al., 2018). Les extraits de la racine et de l’écorce de cette même plante possèdent des activités antibactériennes (TCHINDA et al., 2017). Une étude in vitro a montré que des extraits méthanoliques de feuilles ont des activités antioxydante et inhibitrice de l’acétylcholinestérase (SONIBAR et al., 2017). Enfin, cette plante attenue l’anxiété et les stress oxydatifs (BEPPE et al., 2015).

– A. amara : La budmunchiamine est un alcaloïde isolé de l’extrait alcaloïdique d’A. amara. Cette molécule présente des activités antimicrobienne et antioxydante (THIPPESWAMY et al., 2015).
– A. anthelmintica : Des saponines de type oléanane ont été isolées des extraits aqueux d’A. anthelmintica. Ces composés ont montré une activité cytotoxique puissante (AL-SAYED et al., 2016). Des études menées sur les feuilles ont montré que l’extrait éthanolique révèle une puissante activité antioxydante (MOHAMED et al., 2013).
– A. chinensis : Les extraits méthanoliques d’A. chinensis possèdent une activité antiproliférative sur les lignées cellulaires cancéreuses HeLa et KB (MANOSROI et al., 2015). Une molécule antioxydante, la quercitine a été isolée chez les feuilles de cette plante (KUMARI
et al., 2011). Les trois saponines isolées de l’écorce de tige d’A. chinensis ont une activité cytotoxique contre un certain nombre de lignées cellulaires tumorales chez l’homme. Ces mêmes composés présentent une activité hémolytique contre les érythrocytes de lapin (LIU et al., 2009).
– A. glaberrima : Un nouveau flavonoïde nommé Albiziaflavan B a été isolé del’écorce de racine d’A. glaberrima. Un test mené sur la molécule a montré une activité antiproliférative contre des cellules cancéreuses humaines dont HeLa (FOTSO et al., 2017).
– A. inundata : Deux saponines triterpeniques de type oléanane ont été extraites des parties aériennes d’A. inundanta. Une cytotoxicité contre les cellules malpighiennes de la tête et du cou ainsi que les cellules de mélanome chez l’homme a été démontrée (ZHANG et al., 2011).
– A. lebbeck : Le lebbeckoside C est une saponine de type acide acacique isolée des écorces de tige d’A. lebbeck. Une activité cytotoxique contre la lignée cellulaire de glioblastome humaine U-87 MG a été observée dans une étude in vitro (NOTE et al., 2018). Un test sur le diabète sucré a été réalisé chez le rat pour évaluer l’activité de l’extrait méthanolique d’A. lebbeck et une activité antihyperglycémique avec un effet antihyperlipidémique a été observée (PATEL et al., 2015). Les extraits aqueux et éthanolique des feuilles d’A. lebbeck auraient une activité anti-inflammatoire (MESHRAM et al., 2015).
– A. antunesiana : Une activité antioxydante a été observée dans les extraits éthanoliques de feuilles et de racines d’A. antunesiana (CHIPITI et al., 2013).
– A. procera : Des études in vivo (chez la souris) des extraits de feuilles d’A. procera ont montré une activité antibactérienne et une activité analgésique. Une activité dépressive du système nerveux central (SNC) a été aussi détectée (KHATOON et al., 2014). L’écorce de la plante possède une activité anti-VIH-1 IN (PANTHONG et al., 2015). Il a été montré aussi qu’A. procera (feuilles) a des activités antioxydantes (KHATOON et al., 2013).

INTRODUCTION

Une étude chimique approfondie a été réalisée sur les graines d’Albizia odorata (RAJEMIARIMOELISOA, 2000) (voir Synthèse bibliographique). Les études préliminaires effectuées sur souris ont montré la toxicité des extraits de cosses de la plante. Les objectifs dans cette partie sont:

– de mettre en œuvre un procédé d’extraction des principes actifs à partir de la poudre de cosses ;

– d’essayer de purifier les extraits en adoptant les techniques de traitement par la chaleur et le fractionnement par le n-butanol ;

– de déterminer la nature chimique et les propriétés physico-chimiques des principes actifs contenus dans les extraits.

MATERIELS ET METHODES

MATERIELS

Matériel végétal

Classification de la plante

Systématiquement, A. odorata est classée comme suit :

Règne : VEGETAL

Embranchement : SPERMAPHYTA

Classe : EQUISETOPSIDEAE

Sous-classe : MAGNOLIIDEAE

Ordre : FABALES

Superordre : ROSANEAE

Famille : FABACEAE

Genre : Albizia

Espèce : odorata

Noms vernaculaires : Différents noms vernaculaires sont attribués à A. odorata selon la région où elle se trouve. Dans la réserve forestière d’Ampijoroa, elle est appelée Fany. Dans le nord, elle est connue sous le nom de Voankazomeloka. A Analalava, elle est appelée Beravany, dans le Menabe, Tainakanga et à Miandrivazo, Mandrisa (RAJEMIARIMOELISOA, 2000).

Description botanique d’Albizia odorata

A. odorata est un arbre pouvant atteindre une hauteur de 25 à 30 m. Il a un fut droit et son diamètre varie de 1 à 1,50 m. Ses feuilles sont composées, bipennées, à 2 ou 3 paires de pennes dont chacune porte 2 à 4 paires de folioles de taille assez grande. Sa corolle tubuleuse est deux fois plus longue que le calice. Les inflorescences sont groupées par deux. Ses étamines sont courtes et de couleur blanche. Ses fruits sont plats, indéhiscents, oblongs, coriaces, avec 8 à 10 saillies ovales, transversales qui correspondent aux graines. L’aréole de la graine a une forme de croissant avec les dimensions suivantes : 1,5 mm de longueur, 0,6 mm de largeur et 0,1 mm d’épaisseur (RAJEMIARIMOELISOA, 2000).

Répartition géographique

La plante se répartit dans plusieurs zones de la Grande île : depuis la région d’Antsiranana jusqu’à Miandrivazo (figure 2, page 15) ; à savoir le massif calcaire de l’Ankarana, la forêt d’Ambalantsingy (Analalava), la forêt de l’Antsingy (Morafenobe), la forêt d’Analabo (Antsalova), la forêt d’Ankilimipoaka (Miandrivazo) (RAJEMIARIMOELISOA, 2000).

Date et lieu de récolte

Les cosses utilisées au cours de cette étude ont été récoltées au mois de juin 2015 à Ankarafantsika (16° 09’ S, 46° 57’ E) (figure 1).

Préparation et conservation du matériel végétal

Après leur récolte, les cosses sont séchées à la température ambiante à l’abri du soleil, séparées des graines, puis découpées. Ensuite, elles sont réduites en poudre à l’aide d’un broyeur robot de marque Blender (Robot coupe GT 550). La poudre obtenue est conservée dans des bocaux stériles hermétiquement fermés à la température ambiante. Elle constitue le matériel d’étude.

Produits chimiques et autres matériels

Durant toutes les expériences réalisées, les produits chimiques utilisés sont en général de marque Merck et Prolabo, de qualité pure ou « pour analyse ».

Pour la chromatographie sur couche mince (CCM), le support utilisé est le gel de silice (Merck) muni d’un indicateur de fluorescence, étalé sur une plaque en plastique prête à utiliser et de dimensions 20 × 20 cm, d’épaisseur 0,2mm.

METHODES

Méthodes d’extraction

Principe : La méthode consiste à séparer les constituants que renferme un organe de ce dernier.

Extraction à froid

La poudre de cosses est mise en suspension dans le solvant d’extraction (soit de l’eau distillée ou ED, soit de la solution hydroéthanolique composée de 75% d’éthanol et 25% d’ED) selon le rapport 1/10 (p/v), c’est-à-dire 1g de poudre dans 10 ml de solvant. Le mélange obtenu est soumis à une agitation magnétique pendant une durée d’au moins 3 h, puis laissée macérer à +4°C pendant au moins 12 h. Le macérat est soumis à une agitation de 30 min minimum, puis filtré sur quatre épaisseurs de gaze. Le filtrat obtenu est centrifugé à 10 000 tours/min pendant 15 min à l’aide d’une centrifugeuse de marque Hettich (UNIVERSAL II). Après centrifugation, le culot est écarté et le surnageant est évaporé à sec en utilisant un évaporateur rotatif de marque BÜCHI (ROTAVAPOR-R110). Le résidu obtenu est repris dans de l’ED selon le rapport 1/1 (p/v).

Extraction à chaud

La poudre végétale est mélangée avec de l’ED selon le rapport 1/20 (p/v). Le mélange est porté à l’ébullition (décoction) dans un ballon sur une plaque chauffante pendant 3 h. Après refroidissement, la suite de l’opération est la même que pour l’extraction à froid.

Méthodes de purification (BRUNETON, 1993 ; GEORGE et al., 1999 ; KAMOUN, 1991)

Traitement par la chaleur

Principe :

La technique consiste en l’élimination de certaines molécules qui précipitent sous l’effet de la chaleur, comme les protéines et les acides nucléiques.

Mode opératoire :

L’extrait à traiter versé dans un tube à essai, est chauffé au bain-marie bouillant pendant 15 min. Après refroidissement, par centrifugation à 10 000 tours/min (centrifugeuse Hettich Universal II), le précipité est éliminé sous forme de culot et le surnageant est recueilli.

Fractionnement par le n-butanol

Principe :

Il consiste en la séparation liquide-liquide des substances entre deux solvants non miscibles et de polarités différentes tels que le n-butanol et l’eau. Les substances migrent dans la phase extractive (n-butanol) pour laquelle elles ont plus d’affinité.

Mode opératoire :

L’extrait à purifier est mélangé volume à volume avec le n-butanol dans une ampoule à décanter. Après une agitation énergique, le mélange est laissé décanter jusqu’à ce qu’il y apparaisse deux phases distinctes. La phase organique supérieure est recueillie, tandis que la phase aqueuse inferieure subit deux autres fractionnements. Au final, toutes les phases organiques sont rassemblées, additionnées d’un volume d’ED et évaporées pour éliminer le n-butanol. Pour la phase aqueuse, elle est aussi additionnée d’ED, puis évaporée pour éliminer le n-butanol retenu pendant la séparation.

Méthode de concentration (AUDIGIER et DUPONT, 1992)

Après chaque extraction et chaque étape de purification, les extraits sont concentrés ou évaporés à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif de marque Büchi (Rotavapor R 110) à une température comprise entre 45 et 50°C. Quant à la pression, elle est réduite au moyen d’une pompe à vide de marque ALCATEL (PASCAL 2005 C1).

Calcul de rendement (MAHUZIER et HAMON, 1990)

Types de rendements

Trois types de rendements sont à déterminer :

– le rendement d’extraction par rapport au matériel de départ (poudre) ;

– le rendement de purification par rapport à l’extrait brut ;

– le rendement en toxine de l’extrait purifié par rapport au matériel de départ.

Apres l’extraction et le fractionnement par le n-butanol, les extraits ont été évaporés à sec. Les résidus secs obtenus ont été pesés.

Méthode de calcul du rendement

Après chaque évaporation à sec des extraits (brut et purifié), chacun des résidus secs est pesé à l’aide d’une balance à précision de marque ACCULAB (Biomerieux 2005086). Le rendement est calculé comme suit : =−×

Avec :

R: rendement

Ps : poids du ballon contenant le résidu sec après évaporation (g)

Pv: poids du ballon à vide (g)

D : poids du matériel de départ (poudre végétale) (g)

Méthodes analytiques

Chromatographie sur couche mince (CCM)

Le but est de séparer les différents constituants d’un mélange, afin d’en connaître leur nombre et de les identifier.

Principe :

Pour les séparer, les constituants d’un mélange sont entrainés au moyen d’un solvant ou mélange de solvants (éluant ou phase organique mobile) sur un support composé d’une couche de matériel adsorbant (phase stationnaire aqueuse). La vitesse de migration d’un composé dépend à la fois de son affinité pour le support adsorbant et de sa solubilité dans la phase mobile.

Mode opératoire :

Dépôt des échantillons :

A l’aide d’un capillaire, les extraits brut et purifié à analyser sont déposés sur le support. Les échantillons sont déposés sur des traits fins horizontaux de 7 mm espacés de 6 mm, situés à 1,5 cm des bords inferieurs et latéraux de la plaque. Chaque extrait est déposé trois fois, et après chaque dépôt, un séchage immédiat au séchoir à main est recommandé.

Développement du chromatogramme :

Le système de solvants B/A/E (Butanol/Acide acétique/Eau distillée) sous le rapport 60/20/20 (p/p/p) est utilisé comme éluant. Il est versé dans une cuve chromatographique (DESAGA). Après avoir laissé la cuve se saturer en vapeur du système de solvants, la plaque déjà préparée y est introduite. Le solvant migre par capillarité le long de la plaque jusqu’environ 0,5 cm du bord supérieur où la chromatographie est arrêtée. La plaque est retirée de la cuve et séchée immédiatement au séchoir à main.

Révélation de la plaque :

Deux techniques sont utilisées pour révéler le chromatogramme :

– l’observation sous lumière ultra-violette (UV) : aux longueurs d’ondes 254 nm et 366 nm, les composants se présentent sous forme de taches fluorescentes.

– la révélation au réactif à la vanilline sulfurique : du réactif à la vanilline sulfurique est pulvérisé sur la surface de la plaque. Les constituants ayant migré apparaissent sous forme de taches colorées après chauffage à 120°C pendant 5 min.

La composition du réactif à la vanilline sulfurique est donnée en Annexe III

Criblage phytochimique (Détection des familles chimiques)

Le criblage (screening) phytochimique est l’ensemble de techniques utilisées pour déterminer les familles chimiques des métabolites secondaires que renferme un échantillon végétal. Il est basé sur des réactions de coloration et de précipitation caractéristiques de chacune des familles. A partir de la poudre végétale ou du résidu d’évaporation à sec de l’extrait à analyser, quatre types d’extrait sont préparés au préalable : un extrait aqueux, un extrait hydroéthanolique 75%, un extrait chloroformique et un extrait acide.

Préparation des extraits

Extrait aqueux

Cinq cents milligrammes de poudre végétale ou de résidu d’évaporation à sec d’extrait sont mélangés avec 10 ml d’ED dans un tube à essai. Le mélange est porté à l’ébullition au bain-marie bouillant pendant 30 min. Après refroidissement, celui-ci est laissé macérer à +4°C pendant au moins 12 h. Le macérat est filtré et le filtrat constitue l’extrait aqueux.

Extrait hydroéthanolique

Dans un tube à essai, 500 mg de poudre ou de résidu sec sont mis en suspension dans 10 ml de mélange hydroéthanolique 75%. Après macération pendant au moins 12 h à +4°C, le macérat est filtré et le filtrat constitue l’extrait hydroéthanolique.

Extrait acide

Dix millilitres d’acide chlorhydrique (HCl) 2 N sont mélangés avec 500 mg de poudre végétale ou de résidu sec dans un tube à essai. Le tout est filtré après macération à 4°C pendant au moins 12 h et le filtrat représente l’extrait acide.

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. DESCRIPTION DU GENRE Albizia
II. Utilisations des Albizia étrangéres
II.1 Utilisations traditionnelles
II.2 Données pharmacologiques et constituants isolés de quelques espèces d’Albizia
III. Les Albizia malgaches : études menées au LABASM
III.1. Principaux métabolites secondaires rencontrés
III.2. Propriétés biologiques
III.2.1. Toxicité sur souris
III.2.2. Activité sur les microorganismes
III.2.3. Activités sur les animaux à sang froid
III.2.4. Effets des extraits d’Albizia sur les insectes
III.2.5. Effets sur les végétaux
III.3 Les travaux antérieurs sur Albiziaodorata
III.3.1. Analyses phytochimiques
III.3.2. Isolement du principe actif
III.3.3. Tests biologiques sur différents animaux
III.3.4. Etude de l’activité antimicrobienne
I. INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1. MATERIELS
II.1.1.Materiel végétal
II.1.1.1. Classification de la plante
II.1.1.2 Description botanique d’Albizia odorata
II.1.1.3 Répartition géographique
II.1.1.4 Date et lieu de récolte
II.1.1.5 Préparation et conservation du matériel végétal
II.1.2 Produits chimiques et autres matériels
II.2 METHODES
II.2.1 Méthodes d’extraction
II.2.1.1 Extraction à froid
II.2.1.2 Extraction à chaud
II.2.2 Méthodes de purification
II.2.2.1 Traitement par la chaleur
II.2.2.2 Fractionnement par le n-butanol
II.2.3 Méthode de concentration
II.2.4 Calcul de rendement
II.2.4.1 Types de rendements
II.2.4.2 Méthode de calcul du rendement
II.2.5 Méthodes analytiques
II.2.5.1 Chromatographie sur couche mince (CCM)
II.2.5.2 Criblage phytochimique (détection des familles chimiques)
II.2.5.2.1 Préparation des extraits
a) Extrait aqueux
b) Extrait hydroéthanolique
c) Extrait acide
d) Extrait chloroformique
II.2.5.2.2 Détection des familles chimiques
a) Détection des iridoïdes
b) Détection des anthraquinones : test de BORNTRAGER
c) Détection des désoxyoses : test de KELLER-KILIANI
d) Détection des tanins et autres polyphénols
e) Détection des saponosides : test de mousse
f) Détection des flavonoïdes et leucoanthocyanes
g) Détection des alcaloïdes : tests de MAYER, WAGNER et DRAGENDORFF
h) Détection des stéroïdes et triterpènes : test de LIEBERMANN-BURCHARD
III. RESULTATS
III.1 EXTRACTION
III.2 PURIFICATION
III.2.1 Traitement par la chaleur
III.2.2 Fractionnement par le n-butanol
III.3 RENDEMENT DE PURIFICATION
III.4 ANALYSE DES EXTRAITS
III.5 CARACTERISATION CHIMIQUE
III.5.1 Propriétés physico-chimiques
III.5.2 Nature chimique
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
I.INTRODUCTION
II. MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1 Les animaux d’expérimentation
II.1.1.1 Les animaux à sang chaud : les souris
II.1.1.2 Les animaux à sang froid : les larves de moustiques
II.1.2 Les végétaux d’expérimentation
II.1.3 Les matériels utilisés en microbiologie
II.1.3.1 Les microorganismes
II.1.3.2 Les milieux de culture
II.1.3.2.1 Le milieu solide
II.1.3.2.2 Le milieu liquide
II.1.3.3 Les disques pour antibiogramme
II.2.1 Méthodes d’étude des effets sur les animaux à sang chaud
II.2.1.1Estimation de la toxicité
II.2.2 Test sur les animaux à sang froid (larves de moustique)
II.2.3 Méthodes d’étude des effets sur les végétaux
II.2.3.1 Etude des effets sur la germination
II.2.3.2 Etudes des effets sur la croissance des jeunes plantules
II.2.4 Méthodes d’étude des effets sur la croissance des microorganismes
II.2.4.1 La stérilisation
II.2.4.2 Etude de l’activité antimicrobienne
II.2.4.3 Détermination de la CMI
II.2.4.4 Détermination de la CMB
III. RESULTATS
III.1 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES SOURIS
III.1.1 Symptômes développés après injection d’une dose létale égale à 1200 mg/kg
III.1.2 Symptômes développés après injection d’une dose sublétale égale à 200,67 mg/kg par voie ip
III.1.3 Symptômes après injection par voie orale (per os) d’une dose égale 1650 mg/kg
III.1.4 Détermination de la DL50 (24 h) par voie intrapéritonéale
III.2 EFFETS DE L’EXTRAIT SUR LES LARVES DE MOUSTIQUE
III.3 EFFETS DE L’EXTRAIT BRUT SUR LES VEGETAUX
III.3.1 Effets sur la germination des graines
III.3.2 Effets de l’extrait brut (EB) sur la croissance des jeunes plantules
III.4 EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES
III.4.1 Activité antimicrobienne
III.4.2 Valeur de la CMI
III.4.3 Valeur de la CMB
IV. DISCUSSION ET CONCLUSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
REFERENCES WEBOGRAPHIQUES