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La protéine virale Rev
Malgré le grand nombre de médicaments disponibles contre le VIH, le développe-ment de nouvelles stratégies thérapeutiques reste d’intérêt de part les problèmes de pharmacorésistance et des effets secondaires des antirétroviraux à plus ou moins long terme. Une des étapes du cycle viral qui n’est pas encore ciblée par un mé-dicament est l’export nucléaire des transcrits viraux non épissés et partiellement épissés (Figure 1.4). Dans une cellule non infectée, les ARN complètement épissés sont exportés vers le cytoplasme, tandis que les transcrits incomplètement épissés sont retenus dans le noyau et dégradés. Le VIH évite cette dégradation grâce à la protéine régulatrice Rev (Regulator of expression of the virion), qui se lie aux trans-crits incomplètement épissés et permet leur export dans le cytosol. Rev joue aussi un rôle dans la traduction des ARNm viraux, est impliqué dans l’encapsidation du génome viral et inhibe l’import nucléaire de l’intégrase virale, tout en facilitant son export (Levin et al., 2010a ; Levin et al., 2010b ; Jeang, 2012). La réplication virale est bloquée si la fonctionnalité de Rev est compromise (Cochrane, 2004 ; Sood et al., 2007).
Rev est une protéine de 116 résidus (13 kDa), qui n’est pas présente dans la particule virale, mais qui est l’une des trois premières protéines produites lors de l’infection cellulaire (Jeang, 2012). Rev fixe l’ARN viral en reconnaissant un élément intronique appelé le RRE (Rev-Response Element ), une région de 340 nucléotides très struc-turée, formée de plusieurs éléments tiges-boucles. Un premier monomère de Rev se lie avec haute affinité à un petit domaine du RRE, la tige-boucle IIB, entraînant la multimérisation de Rev sur le RRE entier (Iwai et al., 1992 ; Mann et al., 1994). Le complexe Rev/ARN est ensuite exporté par CRM1 vers le cytosol, permettant la synthèse des protéines virales et l’encapsidation du génome viral.
L’import/export nucléaire de cargos
Le transport nucléocytoplasmique : notions générales
Le trafic macromoléculaire entre le cytoplasme et le noyau est une activité fonda-mentale de la cellule eucaryote. Ces deux compartiments cellulaires sont séparés par l’enveloppe nucléaire, une structure composée de deux membranes. La membrane externe est en continuité avec le réticulum endoplasmique, tandis que la membrane interne entoure la lamina nucléaire et la chromatine. Les deux membranes fusionnent à de nombreuses zones où elles sont perforées par des pores nucléaires (Nuclear Pore Complexes (NPC)). La Figure 1.8 présente un exemple de coupe transversale de cellule animale avec une mise en évidence du noyau et des pores nucléaires. Ces struc-tures, similaires à des canaux, sont composées d’environ 500 polypeptides nommés nucléoporines (Nups ; Alber et al., 2007). Tandis que les ions, les métabolites et les macromolécules de poids moléculaire inférieur à 30-40 kDa peuvent transiter par le NPC par diffusion passive, la plupart des protéines et des molécules d’ARN ont besoin de récepteurs spécifiques pour traverser l’enveloppe nucléaire. C’est le cas par exemple des ARN messagers et de transfert qui doivent quitter le noyau pour assu-rer la synthèse des protéines dans le cytoplasme. C’est le cas aussi de nombreuses protéines produites dans le cytoplasme qui exercent une fonction dans le noyau, y compris des protéines ayant un rôle dans la réplication et la transcription de l’ADN, le remodelage de la chromatine, et le maintien de la structure du noyau.
La plupart des récepteurs de transport nucléocytoplasmique appartient à la famille de protéines β-karyophérine, appelées aussi importines et exportines. Toutes les ka-ryophérines interagissent avec des Nups et avec Ran, une petite GTPase dont l’état nucléotidique affiche une forte asymétrie de part et d’autre de l’enveloppe nucléaire : elle est principalement liée au GTP dans le noyau et au GDP dans le cytosol. Cette asymétrie est souvent appelé le « gradient de RanGTP ». Les karyophérines ont une forte affinité pour la forme de Ran liée au GTP, RanGTP, et une faible affinité pour RanGDP. Les importines lient leur substrat macromoléculaire (aussi appelés « cargo ») dans le cytosol, transitent par le NPC, et libèrent le cargo dans le noyau lorsqu’elles fixent RanGTP. Les exportines s’associent de manière coopérative avec le cargo et avec RanGTP dans le noyau, formant ainsi un complexe ternaire qui traverse le NPC et se dissocie lorsque le GTP est hydrolysé par Ran, libérant ainsi le cargo dans le cytosol. Ainsi les principaux éléments de la machinerie de trans-port nucléocytoplasmique sont le NPC, les récepteurs de transport et le gradient de RanGTP. Chacun de ces éléments est décrit plus en détail ci-dessous. Ces éléments sont associés à de nombreuses pathologies (Jamali et al., 2011 ; Mor et al., 2014). En particulier, la machinerie cellulaire est exploitée par de nombreux virus pour leurs propres intérêts de réplication, y compris le virus de la grippe, le SARS coronavirus (SARS-CoV), le virus Ebola, le virus Nipah, et le VIH-1 (Chahine and Pierce, 2009 ; Monette et al., 2011 ; Levin et al., 2011 ; Fulcher and Jans, 2011).
Le pore nucléaire (NPC)
D’un poids d’environ 120 MDa chez les vertébrés et d’environ 40 MDa chez la le-vure, le NPC est l’un des plus grands assemblages supramoléculaires dans la cellule eucaryote (Kabachinski and Schwartz, 2015). Il existe environ 3000 NPC par noyau dans une cellule « type » comme celles de la lignée cellulaire immortalisée HeLa (Maul et al., 1972 ; Dultz and Ellenberg, 2010), chacun pouvant permettre le passage d’en-viron 1000 cargos macromoléculaires par minute (Ribbeck and Görlich, 2001). La Figure 1.9 donne une vue plus précise de la structure de ces pores. Grâce à ces clichés de microscopies, nous pouvons observer l’implantation des NPCs à travers l’enveloppe nucléaire (Figure 1.9 (a)) et remarquer des détails structuraux concer-nant leurs parties cytoplasmique et nucléaire (Figure 1.9 (b) et (c)). Le NPC est décrit plus en détail plus loin. Il est composé d’un pore central, d’un anneau cyto-plasmique et d’un anneau nucléoplasmique. L’anneau cytoplasmique est attaché à des filaments de longueur ≃ 35 nm, tandis que l’anneau nucléoplasmique est attaché à des filaments qui forment une structure en forme de panier.
Chaque NPC est constitué de nombreuses copies d’environ 30 nucléoporines (Nups), organisées en une symétrie octogonale autour du centre du canal du NPC. Les Nups sont organisées en plusieurs sous-complexes, dont les plus étudiés sont les complexes Nup62, Nup214, Nup93 et Y (ou Nup107 ; Kabachinski and Schwartz, 2015). Les structures atomiques de plusieurs Nups ou de leurs fragments ont été déterminées. Plusieurs possèdent des domaines de « β-propeller » ou de solénoïde α-hélicoïdale, ce qui d’un point de vue évolutif suggère une origine commune avec les protéines karyophérines et les complexes de revêtement des vésicules tels que COPI, COPII et clathrine (Devos et al., 2004 ; Brohawn et al., 2008). Certaines nucléoporines, les FG-Nups, possèdent des « domaines FG », nommés ainsi du fait de leur compo-sition riche en phénylalanine et glycine. Ces domaines comportent plusieurs (de 5 à 50) répétitions du motif Phe-Gly, séparées par des séquences de résidus hydro-philes (Terry and Wente, 2009). Ces régions sont intrinsèquement désordonnées et peuvent s’étendre jusqu’à 200 nm de longueur (Denning et al., 2003 ; Strawn et al., 2004).
Le gradient de RanGTP
Ran est une protéine abondante de 25 kDa, qui appartient à la famille Ras des petites GTPases. Le rôle de Ran dans l’import nucléaire des protéines a été décou-vert en 1993 (Moore and Blobel, 1993) et son rôle dans l’import et l’export des autres cargos a été établi dans les 5 années suivantes (pour revue : Azuma and Dasso, 2000). Par la suite, il a été découvert que Ran joue un rôle important dans plusieurs processus cellulaires, dont l’assemblage du fuseau mitotique (Carazo-Salas et al., 1999 ; Ohba et al., 1999), l’assemblage post-mitotique de l’enveloppe nucléaire (Hetzer et al., 2000 ; Zhang and Clarke, 2000) et des NPC (Walther et al., 2003), la duplication du centrosome (Budhu and Wang, 2005), l’apoptose (Wong et al., 2009), et le trafic ciliaire (Dishinger et al., 2010). Ran, comme les autres GTPases, subit des cycles d’échange de GTP suivi par son hydrolyse en GDP (Figure 1.11). La cinétique de ces deux étapes est fortement accélérée par l’association de Ran avec d’autres facteurs cellulaires. L’hydrolyse du GTP est stimulée par RanGAP (Ran GTPase-activating protein ; Bischoff et al., 1994) et par les protéines RanBP1 (Ran Binding-Protein 1 ) et RanBP2 (Bischoff et al., 1995 ; Wu et al., 1995), tandis que le remplacement de GDP par GTP est stimulé par le facteur d’échange de guanine, RanGEF (Ran Guanine Nucleotide Exchange Factor ), nommé RCC1 (Regulator of Chromosome Condensation 1 ) chez les vertébrés (Bischoff and Ponstingl, 1991). Fait important, ces facteurs sont distribués de façon asymétrique dans la cellule. Ran-GEF a une haute affinité pour la chromatine et par conséquent sa localisation est limitée au noyau, alors que RanGAP, RanBP1 et RanBP2 sont localisées dans le cytosol ou sur les filaments cytosoliques du NPC. Cela donne lieu à une répartition asymétrique de Ran : la forme nucléaire est principalement liée au GTP, la forme cy-tosolique au GDP. Cette asymétrie est critique pour la directionnalité du transport nucléocytoplasmique.
Amélioration du protocole
Le protocole de purification d’Impβ précédemment décrit n’était pas idéal puisque nous n’étions pas sûrs de bien séparer les formes agrégées ou multimériques d’Impβ de sa forme monomérique (Figure 2.3 (c)). J’ai donc choisi d’ajouter sur Impβ une étiquette histidine ainsi qu’un site de clivage à la protéase TEV dans le but d’augmenter le degré d’homogénité de la protéine.
La nouvelle purification d’Impβ nécessite plusieurs étapes de chromatographie (Figure 2.2 (b)). La première est une étape d’affinité Ni-NTA. Cette étape permet de ré-cupérer Impβ, mais de nombreux contaminants sont toujours présents (Figure 2.4 (a)). Après incubation avec la protéase TEV pour éliminer l’étiquette histidine, la solution contenant Impβ est à nouveau chargée sur la résine Ni-NTA afin de retenir spécifiquement la protéase TEV (contenant une étiquette poly-histidine), l’étiquette poly-histidine clivée ainsi que la protéine de fusion His-TEV-ImpB qui n’avait pas été digérée (Figure 2.4 (b)). La protéine Impβ dépourvue de son étiquette poly-histidine est alors retrouvée dans le filtrat.
Très peu d’Impβ est détectée dans l’éluat après le deuxième passage sur la résine Ni-NTA montrant une bonne efficacité de clivage (Figure 2.4 (d)). Une dernière étape de gel filtration permet d’éliminer les agrégats solubles qui sortent près du volume mort de la colonne (Figure 2.4 (c) et (d)). Ce protocole permet d’obtenir entre 50 et 60 mg d’Impβ pour 12 litres de milieu de culture. C’est un meilleur rendement que le protocole utilisant la résine de Sepharose-Impα. En utilisant les techniques MALDI et ESI en spectrométrie de masse, j’ai confirmé que la masse de la protéine purifiée correspondait à celle d’Impβ entière (les spectres sont présentés dans l’Annexe D, page 192). L’analyse par MALDI a aussi révelé une espèce minoritaire d’Impβ sous forme dimérique. Ce dimère ne semble pas être un artefact (voir plus loin les données de SEC/MALLS ; 2.4.2 , page 53).
Rev peut être purifié dans une forme monomé-rique
Premières tentatives de purification de Rev isolé
La purification de Rev recombinant sous forme sauvage présente deux obstacles im-portants. Le premier est que Rev se lie fortement à des acides nucléiques (contami- nants bactériens) de part le nombre important de résidus basiques dans le motif riche en arginine (Arginine Rich Motif (ARM)). Le deuxième est sa tendance à s’agréger ou à précipiter, très probablement à cause des résidus hydrophobes responsables de la multimérisation de Rev.
Dans un premier temps, j’ai décidé de suivre un protocole de purification de Rev publié en 2009 (Marenchino et al., 2009). Ce protocole comprend une dénaturation chimique de Rev suivie par une étape de renaturation sur colonne. J’ai testé ce protocole avec une construction disponible au laboratoire comprenant une étiquette poly-His fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP), un site de clivage à la protéase TEV et la protéine Rev. Le protocole de purification est résumé dans la Figure 2.5 et les résultats d’une purification typique sont présentés dans la Figure 2.6. Comme le montre la Figure 2.6 (a), la protéine His-GFP-Rev est récupérée dans une forme très pure après la première colonne d’affinité Ni-NTA. Cependant après clivage à la protéase TEV, les protéines Rev et His-GFP-Rev sont toutes les deux présentes dans le filtrat et l’éluat de la deuxième colonne Ni-NTA, alors qu’on s’attend à avoir Rev dans le filtrat et His-GFP-Rev dans l’éluat. L’hypothèse est que cela serait dû à une agrégation de Rev : l’association de Rev libre à des molécules His-GFP-Rev pourrait donner des espèces moléculaires qui se trouvent dans l’éluat ou dans le filtrat selon que la queue poly-His est stériquement accessible ou non. Cette hypothèse pourrait être corrélée avec une très forte précipitation de Rev observée pendant l’étape de clivage à la protéase TEV (Figure 2.6 (b)).
De façon intéressante, après une étape de concentration et de gel filtration, le pic majoritaire ne contient que Rev (Figure 2.6 (c)). Le pic minoritaire contient His-GFP-Rev (données non montrées), mais sa faible concentration suggère que cette protéine a probablement précipitée pendant l’étape de concentration. Malheureuse-ment le pic contenant Rev sort à un volume correspondant au volume mort de la colonne, indiquant que Rev est très probablement sous forme d’agrégats solubles, une forme peu idéale pour les études biophysiques et structurales que nous souhaitons réaliser.
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Table des matières
1 Introduction
1.1 Généralités sur le VIH/SIDA
1.1.1 Origines et histoire naturelle de l’infection au VIH
1.1.2 Structure, génome et cycle cellulaire du VIH-1
1.1.3 Médicaments dirigés contre le VIH
1.1.4 Progrès biomédicaux passés et présents – perspectives dans la recherche sur le VIH
1.2 La protéine virale Rev
1.3 L’import/export nucléaire de cargos
1.3.1 Le transport nucléocytoplasmique : notions générales
1.3.2 Le pore nucléaire (NPC)
1.3.3 Le gradient de RanGTP
1.3.4 Les karyophérines-β
1.3.5 Voie classique d’import nucléaire
1.3.6 Des cargos qui interagissent directement avec Impβ
1.3.7 Import nucléaire de Rev : Impβ et/ou Transportin ?
1.3.8 Structure et flexibilité conformationelle d’Impβ
1.4 Objectif de la thèse
2 Résultats
2.1 Choix de stratégie pour la purification d’Impβ/Rev
2.2 Purification d’Impβ
2.2.1 Protocole initial de purification
2.2.2 Amélioration du protocole
2.3 Rev peut être purifié dans une forme monomérique
2.3.1 Premières tentatives de purification de Rev isolé
2.3.2 Deuxième protocole de purification de Rev
2.3.3 Analyse de Rev par SEC/MALLS
2.3.4 Confirmation de la structure secondaire de Rev par RMN
2.4 Rev et Impβ forment un complexe stable
2.4.1 Analyse du complexe Impβ/Rev par SEC
2.4.2 Analyse du complexe Impβ/Rev par SEC/MALLS
2.4.3 Visualisation du complexe Impβ/Rev par microscopie électronique
2.5 Tentatives de cristallogénèse
2.5.1 Par criblage à haut débit
2.5.2 Utilisation de mutants entropiques d’Impβ
2.5.3 Tentatives de cristallogénèse de manière pseudo-rationnelle
2.6 Impβ reconnait Rev par son domaine N-terminal
2.6.1 Analyse par RMN de Rev en présence et en absence d’Impβ
2.6.2 Identification d’épitopes de liaison par balayage peptidique
2.7 Rev fixe Impβ avec moins d’affinité que le motif ARM
2.7.1 Analyse par TSA
2.7.2 Analyse par polarisation de fluorescence
2.8 Compétition d’Impα et Ran sur Rev-NLS/Impβ
2.8.1 Compétition entre Rev-NLS et Impα
2.8.2 Absence de compétition entre Rev-NLS et Ran
2.9 Impβ fixe deux monomères de RevV 16D/I55N
2.9.1 Première évidence par gel natif
2.9.2 Quantification sur gel du complexe purifié par SEC
2.9.3 Quantification des acides aminés du complexe purifié par SEC
2.9.4 Réticulation chimique suivie de spectrométrie de masse
2.9.5 Analyse par spectrométrie de masse en condition native
2.10 Impβ fixe un seul monomère de RevV 16D
2.10.1 Analyse par spectrométrie de masse en condition native
2.11 L’interaction Impβ/Rev est enthalpiquement favorisée
2.12 Un nombre limité de configurations d’Impβ/Rev
2.12.1 Étape 1 : identification des résidus d’Impβ susceptibles d’interagir avec Rev
2.12.2 Étape 2 : Amarrage moléculaire (Docking) par HADDOCK
2.13 Analyse du complexe Impβ/Rev par SAXS
2.13.1 Paramètres déterminés indépendamment d’un modèle atomique
2.13.2 Modèles à billes calculées ab initio
2.13.3 Évaluation des modèles HADDOCK : 1er essai
2.13.4 Évaluation des modèles HADDOCK : 2me essai
3 Conclusions et perspectives
3.1 Perspective d’un modèle structural du complexe
3.2 À propos de la stœchiométrie Impβ : Rev
3.3 Conclusion
4 Matériels et méthodes
4.1 Stratégies globales utilisées pour le clonage
4.1.1 Importin β incorporant une étiquette histidine
4.1.2 Mutagenèse dirigée
4.2 Production et purification des protéines
4.2.1 Purification de la protéase TEV
4.2.2 Purification d’Importin α et préparation de la colonne d’affinité134
4.2.3 Purification d’Importin β
4.2.4 Rev
4.2.5 RanQ69L
4.3 Gels natifs
4.4 Réticulation protéique au glutaraldéhyde
4.5 Quantification sur gel dénaturant
4.6 Determination de la composition en acides aminés
4.7 Fluorimétrie différentielle à balayage
4.8 Polarisation de Fluorescence
4.8.1 Généralités sur la technique
4.8.2 Courbes d’associations entre Rev et Impβ
4.8.3 Compétition avec Rev-NLS ou RevV 16D/I55N
4.8.4 Compétition avec Impα
4.8.5 Expériences réalisés avec RanGTP
4.9 SEC/MALLS à l’aide de la plateforme PAOL
4.10 Spectrométrie de masse
4.10.1 Spéctrométrie de masse LC/ESI-MS
4.10.2 Spectrométrie de masse MALDI-TOF
4.10.3 Spectrométrie de masse en conditions natives
4.11 Titration calorimétrique isotherme
4.12 Résonance Magnétique Nucléaire
4.13 Microscopie électronique
4.14 Cristallogénèse
4.15 Amarrage moléculaire (Docking)
4.16 Diffraction des rayons X aux petits angles
Bibliographie
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