Mécanismes de résistance aux antibiotiques
La résistance des entérobactéries aux antibiotiques est un problème d’importance croissante en pratique médicale. Au fur et à mesure de la découverte de nouveaux antibiotiques, les bactéries ont progressivement accumulé dans leur matériel génétique les gènes conduisant à la multi résistance. Trois familles d’antibiotiques (Bêta–lactamines, Aminosides, Quinolones) peuvent être utilisées contre les entérobactéries multirésistante.
Mécanismes de résistance aux Bêta -lactamines
Résistance non enzymatique
Diminution de la perméabilité :
La pénétration des β-lactamines, molécules hydrophiles à travers la membrane externe s’effectue à travers les porines. Ainsi, la sensibilité aux β-lactamines dépend du nombre des porines fonctionnelles. L’altération des porines par mutation est à l’origine de résistances acquises aux βlactamines, soit par une modification structurale d’une porine essentielle, ce qui a été décrit chez E. coli, soit par une diminution quantitative des porines, qui est la situation la plus fréquente (Kumar, A., Schweizer, H.P., 2005).
Bien que plus rare, la disparition de porine provoque l’augmentation des Concentration minimale inhibitrice (CMI) de certaines β- lactamines comme : Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter cloacae, Salmonella typhimurium et Echerichia coli (Yoshimura, F. , Nikaido, H., 1982; Nikaido, H., 2000 ).
Modification de PLP :
La résistance aux β-lactamines conférée par les PLPs (protéine liant a la pénicilline) (Spratt, B.G., et al., 1989). Cette résistance peut avoir lieu par des mutations dans les gènes chromosomiques codant pour les PLPs ou par l’acquisition de gènes étrangers codant pour des nouveaux PLPs ayant une affinité différente aux β-lactamines (Georgopapadakou, N.H., 1993). Chez les entérobactéries, Proteus mirabilis résistantes à l’imipenème et au mécillinam ont été observées suite à une perte d’affinité de la PLP2 et à une diminution de la quantité de PLP1. Cependant, ce type de mécanisme reste très rare chez les entérobactéries (Neuwirth, C., et al., 1995).
Système d’efflux :
Chez E. coli, différents systèmes d’efflux contenant des pompes RND ont été décrits dont AcrAB-TolC est le mieux caractérisé (Kumar, A., Schweizer, H.P., 2005). Le système AcrAB-TolC est impliqué dans l’excrétion de plusieurs types de molécules incluant l’acriflavine, β-lactamines, sels biliaires, chloramphénicol, Crystal violet, bromure d’éthidium, acides gras, macrolides, solvants organiques, fluoroquinolones(Kumar, A., Schweizer, H.P., 2005) . AcrA est la MFP, c’est une lipoprotéine périplasmique attachée à la membrane interne et interagit avec AcrB et TolC (Masi, M., et al., 2003). TolC est une porine de la membrane externe. Elle forme un canal dans la membrane externe, prolongée par un tunnel périplasmique qui fonctionne comme un pont avec AcrB (Masi, M., et al., 2003). AcrR réprime la transcription de l’opéron acrAB et prévient ainsi une hyperproduction d’AcrAB (Kumar, A., Schweizer, H.P., 2005).
Résistance enzymatique
Résistance naturelle ou phénotypes « sauvages »
Historiquement, quatre groupes des entérobactéries avaient été définis sur la base du phénotype de résistance naturelle aux β-lactamines. Depuis la création de nouveaux groupes a été proposée suite à l’évolution de la taxonomie et des connaissances dans le domaine des β-lactamases. Ainsi, 7 groupes des entérobactéries peuvent être différenciés (Tableau 3) (Philippon, A, Arlet, B., 2012) :
Groupe O : inclut les entérobactéries ne possédant aucun gène codant pour une β lactamase.
Groupe 1 : (céphalosporinase constitutive de très bas niveau) : résistance naturelle pour une céphalosporinase de la classe C d’Ambler donc résistante aux inhibiteurs(Robin, F., et al., 2012).
Groupe 2 : (pénicillinase de bas niveau) : inclut les espèces possédant une pénicillinase chromosomique constitutive exprimée à bas niveau .Le phénotype de résistance est caractérisé par une résistance aux aminopénicillines et aux carboxypénicillines.
Groupe 3 : (céphalosporinase inductible) : comprend les espèces des entérobactéries productrices de céphalosporinase AmpC, résistante aux inhibiteurs et inductible par les βlactamines car régulées par un facteur de transcription AmpR. Le phénotype de résistance est marqué par une résistance aux aminopénicillines seules ou associées aux inhibiteurs et une résistance aux C1G (Philippon, A, Arlet, B., 2012).
Groupe 4 : (céphalosporinase inductible + enzyme sensible aux inhibiteurs) : production de deux enzymes: une céphalosporinase inductible de classe C donc résistante aux inhibiteurs et une enzyme sensible aux inhibiteurs.
Groupe 5 : (céfuroximase inductible) : rassemble les espèces produisant une enzyme chromosomique, sensible aux inhibiteurs, inductible et ayant un spectre d’activité hydrolytique proche de celui des BLSE. Ils présentent naturellement une résistance aux aminopénicillines, aux C1G et au céfuroxime, ainsi qu’une sensibilité aux associations d’aminopénicillines et d’inhibiteurs (Philippon, A, Arlet, B., 2012).
Groupe 6 : (BLSE de bas niveau/ BLSE inductible) : possèdent une résistantes aux aminopénicillines, aux carboxypénicillines, aux C1G et au céfuroxime. Elles sont sensibles aux associations de pénicillines-inhibiteurs des β-lactamases. Elles restent habituellement sensibles aux uréïdopénicillines et aux C3G (Robin, F., et al., 2012).
Résistance acquise ou phénotypes « résistants »
Toutes les entérobactéries, quel que soit leur groupe, sont capables d’intégrer des gènes de résistance codant pour une β-lactamase (Zogheib, E., Dupont, H., 2005).
Pénicillinase de haut niveau ou « pénicillinase acquise »
Les pénicillinases des entérobactéries sont nombreuses (TEM-1, TEM-2, SHV-1…) et non inductibles. Environ 75% de bêta-lactamases isolées des entérobactéries sont des TEM-1. Ces enzymes sont codées par des plasmides et donc facilement transférables. Elles confèrent aux bactéries, qui les produisent à haut niveau, une résistance aux amino-pénicillines, carboxypénicillines, uréido-pénicillines, amidinopénicillines,C1G et C2G (Collignon, A., et al., 2007) .
Pénicillinase résistante aux inhibiteurs
Plus récemment, des bêta-lactamases dérivées de pénicillinases plasmidiques entraînant une résistance aux inhibiteurs suicides de bêta-lactamases ont été décrites. Elles sont produites par E. coli, Proteus et Klebsiella. Elles confèrent une résistance à l’amoxicilline et à la ticarcilline, seules ou en association avec l’acide clavulanique et un bas niveau de résistance aux C1G. (Lavigne, J.P., et al., 2002).
Bêta-lactamase à spectre étendu (BLSE)
les BLSE sont des β-lactamases de classe A (comme TEM1/2 et SHV-1), et selon la classification de Bush-Jacoby- Medeiros, les BLSE font aussi partie du groupe 2be, c’est-à-dire qu’elles sont capables d’hydrolyser les pénicillines, les céphalosporines de 1ère, 2ème, 3ème (ex. céfotaxime, ceftazidime) et 4ème (ex. céfépime) génération et les monobactames (ex. aztréonam) (Livermore, D.M., 2008). Par contre, les souches productrices de BLSE restent généralement sensibles aux céphamycines (ex. céfoxitine) et aux carbapénèmes (ex. imipénème). Enfin, les BLSE sont inhibées par les inhibiteurs de β-lactamases (IβL), comme l’acide clavulanique (Livermore, D.M., 2008). Au laboratoire, la détection des BLSE est classiquement basée sur l’observation d’une synergie entre l’acide clavulanique et les C3G, C4G ou l’aztréonam, et une sensibilité conservée à la céfoxitine et à l’imipénème (Bradford P.A., 2001, Paterson D.L., 2006). Plus de 200 BLSE naturelles ont été décrites; elles ont été classées en 11 familles différentes : TEM, SHV, CTX-M, PER,VEB, GES, TLA, BES, SFO, FEC et OXA (Vidon , O. , Bourdin, C., 2005). Les 4 familles majeures : TEM, SHV, OXA et CTX-M (Gniadkowski, M., 2001).
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Table des matières
Introduction
Partie I: Etude bibliographique
1. Les bacilles à Gram Négatif
1. 1. Entérobactéries
1.1.1. Historique et Taxonomie
1.1.2. Habitat
1.1.3. Caractères bactériologiques
1.1.4. Mécanismes de résistance aux antibiotiques
1.1.4.1. Mécanismes de résistance aux Bêta-lactamines
1.1.4.1.1. Résistance non enzymatique
1.1.4.1.2. Résistance enzymatique
1.1.4.2. Mécanismes de résistance aux Aminosides ou Aminoglycosides
1.1.4.3. Mécanismes de résistance aux Quinolones
1.1.5. Epidémiologie
1.1.5.1. A l’échelle mondiale
1.1.5.2. A l’échelle Nationale
1.2. Bacilles à Gram Négatif non fermentants
1.2.1. Pseudomonas aeruginosa
1.2.1.1. Historique et Taxonomie
1.2.1.2. Habitat
1.2.1.3. Caractères bactériologiques
1.2.1.4. Mécanismes de résistance aux antibiotiques
1.2.1.4.1. Mécanismes de résistance aux Bêta-lactamines
1.2.1.4.1.1. Résistance naturelle
1.2.1.4.1.2. Résistance acquise
1.2.1.4.1.2.1. Résistance non enzymatique
1.2.1.4.1.2.2. Résistance enzymatique
1.2.1.4.2. Mécanismes de résistance aux Aminosides
1.2.1.4.3. Mécanismes de résistance aux Quinolones
1.2.1.5. Epidémiologie
1.2.1.5.1. A l’échelle mondiale
1.2.1.5.2. A l’échelle nationale
1.2.2. Acinetobacter baumannii
1.2.2.1. Historique et taxonomie
1.2.2.2. Habitat
1.2.2.3. Caractères bactériologiques
1.2.2.4. Mécanismes de résistance aux antibiotiques
1.2.2.4.1. Mécanismes de résistance aux Bêta–lactamines
1.2.2.4.1.1. Résistance naturelle
1.2.2.4.1.2. Résistance acquise
1.2.2.4.1.2.1. Résistance non enzymatiques
1.2.2.4.1.2.2. Résistance enzymatique
1.2.2.4.2. Mécanismes de résistance aux Aminosides
1.2.2.4.3. Mécanismes de résistance aux Quinolones
1.2.2.5. Epidémiologie
1.2.2.5. 1. A l’échelle mondiale
1.2.2.5.2. A l’échelle nationale
Partie II: Matériel et méthodes
1. Isolement des souches bactériennes
2. Identification des souches
2.1. Système API 20E et API 20NE : (bio Mérieux, France)
2.2. Spectrométrie de masse MALDI-TOF
3. Etude de la sensibilité aux antibiotiques
4. Détermination des concentration minimales inhibitrices (CMI) par E. test
5.Détection phénotypique des β-lactamases
5.1. Recherche de la production du BLSE
5.1.1. Test de synergie
5.1.2. Test de confirmation (technique du double disque)
5.2. Recherche de la production des Carbapénèmases
5.2.1. Test de Hodge modifié
5.2.2. Test à l’EDTA : (pour les métallo-β-lactamases (MβL)
5.2.2.1. Méthode EDTA-disque synergie
5.2.2.2. Méthode des disques combinés
5.2.3. Test Carba NP modifié
6. Détection moléculaires des β-lactamases
6.1. Extration de l’ADN
6.2. Polymérase Chain Réaction (PCR) en temps réel
6.3. Polymérase Chain Réaction(PCR) standard
6.4. Electrophorèse sur gel d’agarose
6.5. Séquençage
6.6. Analyse des séquences d’ADN
6.7. Typage des souches
6.7.1. Biotypage par MALDI-TOF
6.7.2. Génotypage par MLST : (Multi-locus sequence typing)
Partie III: Résultats et Discussion
Résultats
1. Identification des souches bactériennes
1.1. Répartition des souches selon l’espèce
1.2. Répartition des souches selon la nature de prélèvement
1.3. Répartition des souches selon le service
1.4. Répartition des souches selon le sexe
1.5. Répartition des souches selon l’âge
2. Etude de la sensibilité aux antibiotiques
2.1. Antibiogramme par diffusion de disque sur un milieu gélosé
2.2. Concentrations minimales inhibitrices (CMI) par E-test
3. Recherche phénotypique de la résistance aux antibiotiques
3.1. Recherche phénotypique des β-lactamases
3.1.1. Recherche phénotypique des BLSE
3.2. Recherche Phénotypique des carbapénèmases
4. Recherche moléculaire des gènes de résistance
4.1. Recherche moléculaire des β-lactamases à spectre étendu
4.2. Recherche moléculaire des carbapénèmases
4.3. Recherche moléculaire de l’OprD
5. Séquençage et analyse des séquences
6. Arbre phylogénétiques
7.Typage des souches
7.1. Biotypage par MALDI-TOF
7.2. Génotypage par MLST
Discussion
Conclusion
