Le rôle de l’élément SECIS
Les ARNm des sélénoprotéines ont dans leur région 3’-terminale une structure particulière appelée élément SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence). Le SECIS, d’une longueur d’une soixantaine de nucléotides se caractérise par sa forme en « tige-boucle ». Cette architecture particulière va permettre de traduire le codon UGA, normalement codon stop, en sélénocystéine afin d’insérer cette dernière dans la séquence d’acides aminés pour former une sélénoprotéine (Berry et al., 1991; Low and Berry, 1996). Le complexe protéique associé à l’ARNt [ser]sec formant le sélénosome est fondamental pour l’incorporation du 21 ème acide aminé dans les protéines à sélénium. En effet, le SBP2 de ce complexe est un élément central pour la synthèse des sélénoprotéines, car se compose de domaines riches en lysine (K-rich domain) permettant sa liaison au domaine SECIS mais également à la sous unité ribosomale 60S (Takeuchi et al., 2009; Kossinova et al., 2014). De plus, cette protéine va recruter le complexe eEFSEC-ARNt [ser]sec (Fagegaltier et al., 2000). La formation du complexe eEFSEC-ARNt [ser]sec se fait via un domaine particulier de l’eEFSEC. Sa structure, chez l’humain, en forme de calice se compose de 4 domaines, les 3 domaines terminaux possèdent les sites fonctionnels majeurs de cette protéine et ont un repliement de type EF-Tu, alors que le domaine 4 va se lier à l’ARNt [ser]sec et aussi à la SBP2. Ce domaine 4 va avoir une activité GTPase qui joue un rôle essentiel pour la libération de l’ARNt [ser]sec du ribosome (Simonović and Puppala, 2018). La protéine ribosomique L30 va en se liant à l’élément SECIS déplacer le SBP2 et contribue à la libération du complexe eEFSEC-ARNt [ser]sec (Chavatte et al., 2005) (Fig. 4-F). Ainsi, le 21 èmeacide aminé, la sélénocystéine, est inséré dans la protéine pour former une sélénoprotéine.
Le sélénoprotéome
Les sélénoprotéines sont retrouvées quasiment dans l’ensemble des espèces du vivant (Hatfield et al., 2014) et leur identification a été réalisée via deux approches: l’identification par expérimentation biochimique (Gladyshev et al., 1998) ou l’identification par une approche bioinformatique ayant permis l’identification de 25 gènes codant pour les sélénoprotéines humaines composant le sélénoprotéome décrit ci-dessous (Kryukov et al., 2003) (Fig. 4-G). Les sélénoprotéines ont des fonctions diverses, notamment des fonctions d’homéostatie redox, mais aussi des fonctions enzymatiques. Afin de limiter les ambiguïtés concernant les différentes appellations pour des mêmes sélénoprotéines, une nomenclature a été validée par le HUGO Gene Nomenclature Committee en 2016 pour uniformiser ces appellations. Les sélénoprotéines avec des fonctions enzymatiques connues sont désignées par l’acronyme désignant cette fonction et le numéro qui lui est associé. Cette nomenclature s’applique aux thiorédoxine réductases : TXNRD1,…,3, les glutathion péroxidases (GPX1,..,4,6), les iodothyronine déiodinases (DIO1,..,3), la méthionine sulfoxide réductase B1 (MSRB1) et la sélénophosphate synthétase 2 (SEPHS2). Pour les sélénoprotéines dont les fonctions sont moins, voire pas connues, le symbole SELENO a été choisi comme racine commune, suivi de la lettre désignant la sélénoprotéine. Ainsi, une homogénéisation des appellations des sélénoprotéines est reconnue par la communauté scientifique. Sont regroupées dans cette nomenclature les sélénoprotéines suivantes, dont les noms historiques se trouvent entre parenthèses, SELENOF (sélénoprotéine F, 15-kDa sélénoprotéine, SEP15), SELENOH (sélénoprotéine H, SELH, C11or f31), SELENOI (sélénoprotéine I, SELI, EPT1), SELENOK (sélénoprotéine K, SELK), SELENOM (sélénoprotéine M, SELM), SELENON (sélénoprotéine N, SEPN1, SELN), SELENOO (sélénoprotéine O, SELO), SELENOP (sélénoprotéine P, SeP, SEPP1, SELP), SELENOS (sélénoprotéine S, SELS, SEPS1, VIMP), SELENOT(sélénoprotéine T, SELT), SELENOV(sélénoprotéine V, SELV) et SELENOW (sélénoprotéine W, SELW, SEPW1) (Gladyshev et al., 2016).
Dans la mitochondrie : GPX4, TXRND2, SELENOO
• La GPX4 mitochondriale possède les mêmes particularités concernant les substrats pris en charge que les autres isoformes de GPX (Conrad et al., 2007). Il a été montré que la surexpression de cette isoforme dans les lignées tumorales pancréatiques conduit à l’inhibition de la croissance tumorale après transplantation (Trachootham et al., 2006). De plus, cette isoforme est surexprimée entre les stades embryonnaires E14.5 et E17.5 car indispensable au neurodéveloppement (Borchert et al., 2006).
• Isolée à partir d’une banque d’ADNc de surrénale humaine, la TXNRD2 présente de nombreuses homologies avec l’enzyme cytosolique TXNRD1. La TXNRD2, comme la TXNRD1, conserve le site actif CVNVGC qui catalyse de nombreuses réactions redox par son oxydation réversible et est maintenue à l’état réduit via la flavoenzyme qui utilise le pouvoir réducteur du NADPH de façon séquentielle par la paire Cys-Sec. La différence majeure réside dans la présence de 33 acides aminés en N-terminale ayant des propriétés de translocation mitochondriale (Miranda-Vizuete et al., 1999). Comme son homologue, cette thiorédoxine réductase fait partie du système thiorédoxine composé de NADPH qui joue un rôle primordial dans la défense contre le stress oxydatif qui est très présent dans la mitochondrie (Fig. 9) (Lu and Holmgren, 2014).
• Caractérisée dans les cellules de rein humain HEK 293T, le motif CxxU a été identifié dans la partie C-terminale de la protéine SELENOO. Dans ce modèle cellulaire traité par le peroxyde d’hydrogène, la SELENOO présente une oxydation réversible dans le temps.
Ce résultat suggère une interaction redox avec un partenaire protéique inconnu via le résidu Sec de la sélénoprotéine (Han et al., 2014). Une hypothèse émise récemment basée sur la prédiction fonctionnelle et structurelle indique que la SELENOO aurait une fonction kinase, ce qui reste à confirmer expérimentalement (Dudkiewicz et al., 2012).
Dans le réticulum endoplasmique : DIO2, SELENOF, SELENOM, SELENOK, SELENOS, SELENON, SELENOT
• La DIO2 fait partie, avec la DIO1 et DIO3, de la famille des iodothyronine déiodinases. Elle est la seule DIO localisée dans la membrane du RE (Baqui et al., 2000). Cette sélénoprotéine catalyse la déidination de l’hormone T4 en T3, et l’hormone rT3 en T2 (Fig. 8) (St. Germain et al., 2005). La production de T3 dans le SNC via la DIO2 est particulièrement importante au cours du développement, pour la régulation de la thermogenèse et pour les fonctions hypophysaires (St. Germain et al., 2005). Elle est exprimée au niveau du SNC, de la masse graisseuse, de la cochlée, du cœur, du muscle, de la glande pituitaire, du placenta, de la peau (chez l’embryon), des testicules, de la thyroïde et de l’utérus(St. Germain et al., 2005).
• La SELENOF identifiée dans les cellules T humaines (Gladyshev et al., 1998), est localisée dans la thyroïde et la prostate (Korotkov et al., 2001). Cette sélénoprotéine possède un motif hautement conservé, Cys-Gly-Sec-Lys qui suggère un centre actif redox avec une liaison séléno-sulfure entre la Sec et la Cys. L’étude de Korotkov et al. montre que cette sélénoprotéine forme un complexe avec l’UDP-glucose : glycoprotéine glucosyltransférase (UGTR), enzyme impliquée dans le contrôle qualité des protéines. De plus la localisation dans le RE suggère l’implication de la SELENOF dans la régulation du repliement des protéines (Korotkov et al., 2001). La SELENOF est fortement exprimée dans des lignées cellulaires de cancer du côlon laissant penser que ses fonctions redox accrues permettent la prolifération et la métastatisation tumorale des cellules cancéreuses. Le stade ou le grade tumoral pourrait avoir un effet sur l’activité anti ou pro tumorigène car 60% des mésothéliomes malins présentent une régulation négative de l’expression de l’ARNm de cette sélénoprotéine (Hatfield et al., 2014).
• Les caractéristiques et fonctions précises des sélénoprotéines ne sont, pour une partie d’entre elles dont la SELENOM, pas encore totalement connues. Cependant, la SELENOM présente un motif structural de type thiorédoxine, suggèrant un rôle d’oxydoréductase (Liu et al., 2018). En utilisant des modèles in vitro et in vivo, le rôle de laSELENOM dans le métabolisme énergétique a pu être montré. En effet, la leptine favorise l’expression de la SELENOM dans l’hypothalamus. De plus, l’absence de SELENOM entraine une altération de la phosphorylation de STAT3 induite par la leptine. Dans le modèle cellulaire mHypoE-44, la surexpression de la SELENOM améliore la sensibilité à la leptine. Ces résultats indiquent que la SELENOM est un régulateur positif de la signalisation de la leptine au niveau de l’Hyp (Gong et al., 2019).
• LaSELENOK, protéine de 11 KDa, est classée dans la même famille que la SELENOS. Des recherches biochimiques ont montré une interaction entre le complexe ERAD (Endoplasmic-Reticulum-Associated Degradation) et la SELENOK, en particulier via la Derlin-1. La SELENOK co-précipite avec des substrats glycosylés du complexe ERAD et participe à leur dégradation. Dans des modèles de stress du RE par accumulation de protéines mal conformées, le gène de la SELENOK est surexprimé. De plus, des liaisons avec des composants du complexe oligosacharyltransferase (ribophorins, OST48, STT3A) et la calnexine, protéine chaperonne ont été observées (Shchedrina et al., 2011). Enfin, la suppression de la SELENOK dans les cellules immunitaires entraine une diminution du flux Ca2+ ce qui entraine un affaiblissement de l’immunité. Cette diminution du flux de Ca 2+ serait la conséquence d’un défaut de palmitoylation de l’IP3R, elle-même conséquence d’une perturbation du complexe DHHC6/SELENOK (Verma et al., 2011; Fredericks et al., 2014).
• La SELENOS, comme la SELENOK, possède des propriétés redox. Ces 2 protéines ont dans leurs parties C-terminales cytoplasmiques la Sec. La SELENOS est également associée au système ERAD, en se liant aux composants p97 ATPase, derlines et SELENOK. Là où la SELENOK montre une affinité importante pour la derline-1, la SELENOS se lie préférentiellement à la derline-2, suggérant une détermination de la nature des substrats transloqués dans le canal derline par ces sélénoprotéines (Shchedrina et al., 2011). • La SELENON, identifiée par la technique de reconnaissance de séquence in silico (Lescure et al., 1999), est une glycoprotéine du RE. Des mutations du gène codant pour la SELENON sont trouvées chez des patients atteints de myopathie et de dystrophie musculaire avec rigidité rachidienne (Petit et al., 2003). Des souris déficientes en SELENON présentent une résistance à l’insuline (Varone et al., 2019). Fortement exprimée dans les premiers stades du développement embryonnaire et au cours de la régénération ou prolifération cellulaire, cette sélénoprotéine est essentielle mais non vitale pour l’organisme (Petit et al., 2003). La SELENON est un acteur important dans la régulation du Ca 2+ du RE, les variations luminalesdu Ca 2+ entrainent un changement dynamique de la sélénoprotéine améliorant l’interaction redox-dépendante avec la pompe Ca 2+ SERCA qui agit en tant que partenaire de la SELENON, modulant ainsi l’entrée de Ca 2+ dans le RE (Chernorudskiy et al., 2020).
• LaSELENOT, découverte en 1999 par une approche bioinformatique basée sur la recherche de l’élément SECIS (Kryukov et al., 1999) est la sélénoprotéine étudiée dans ce projet de recherche de thèse. Une description complète est développée dans le chapitre I page.
Son rôle neuroprotecteur
Plusieurs études montrent l’importance de la SELENOT dans la protection neuronale, en particulier pour les neurones dopaminergiques. En utilisant des modèles cellulaires et des souris traitées par des neurotoxines, l’implication de cette sélénoprotéine dans le système neuroprotecteur a été démontrée. Une augmentation de l’expression de la SELENOT sous stimulation par la neurotoxine MPP+ a été observée dans les cellules SH-SY5Y. La modification du domaine actif de cette sélénoprotéine, en remplaçant la Sec par la Ser, entraine une chute de la protection cellulaire. La SELENOT protège les cellules en réduisant les ROS induits par la toxicité du MPP+ mais également directement via la phosphorylation de la tyrosine hydroxylase (TH), enzyme essentielle à la production de la dopamine (DA) (Boukhzar et al., 2016). Dans un modèle de cellule SK-N-SH proche des cellules SH-SY5Y, il a été montré que l’inactivation de la SELENOT augmente l’expression de marqueurs de l’apoptose, l’annexin V et caspase-3, et la proportion de cellule en phase G1/S du cycle cellulaire. Des études chez l’animal ou chez des patients post-mortem corroborent l’hypothèse de l’effet protecteur de la SELENOT dans des cellules dopaminergiques (Shao et al., 2019). Chez les souris KO SELENOT conditionnelles, la sensibilité au neurotoxique ciblant les neurones dopaminergiques est exacerbée avec des tremblements qui apparaissent très rapidement et desphases d’immobilité totales. L’absence de SELENOT entraine une augmentation des marqueurs de stress oxydant et des déficits moteurs associés à une baisse de l’activité de la TH. Une augmentation de la SELENOT a aussi été observée au niveau du caudate putamen dans des échantillons de patients humains ayant développé la maladie de Parkinson. Ces données suggèrent un rôle crucial de cette protéine dans la neuroprotection en limitant la dégénération des neurones dopaminergiques et les déficits moteurs associés (Boukhzar et al., 2016). Une petite séquence d’acides aminés de la SELENOT semble être essentielle pour la protection des neurones dopaminergiques. En effet, le peptide PSELT, contenant la séquence CVSU montre un effet protecteur important dans les cellules et de souris modèles de la maladie de Parkinson.
Le PSELT est un peptide pouvant passer les barrières lipidiques des cellules et pénétrer jusqu’au noyau pour stimuler le facteur de transcription EZH2 et induire ainsi l’effet neuroprotecteur. De plus, le PSELT diminue la production de ROS. Dans le modèle animal de la maladie de Parkinson le PSELT réduit l’expression de l’α-synucléine, de la GRP78/Bip et induit celle de sur l’H3K27me3, des gènes qui sont altérés dans la maladie de Parkinson. Le PSELT limite l’apoptose avec une baisse de la caspase-3, réduit l’expression de DJ-1, marqueur du stress oxydatif et rétablit les niveaux de la TH phosphorylée ce qui permet de garder une activation de cette enzyme.
La noradrénaline
La NA qui tire son nom de l’Ad, et dont le préfixe «nor » signifie : dont la fonction aminée n’est pas méthylée, est la CA issue de l’hydroxylation de la DA par la dopamine-β hydroxylase (Fig. 15). Au niveau des cellules neuronales du SNC, cette réaction d’hydroxylation est réalisée dans les vésicules synaptiques à la suite de la capture de la DA via le VMAT-2 (Fig. 16). Un autre transporteur est lui exprimé au niveau périphérique, le VMAT-1, son rôle étant la recapture de la NA au niveau du cytoplasme pour permettre la synthèse de l’Ad dans les granules de sécrétion. Tout comme la DA, la NA peut être recaptée par les transporteurs spécifiques que sont le DAT et le NET au niveau post-synaptique. La découverte et la compréhension du rôle de ces transporteurs des CA furent récompensée par la remise du prix Nobel en 1970 à Julius Axelrod, révélant l’importance de ces recherches et de la fonction de ces transporteurs. La recapture est un moyen de contrôle de l’activité de ces deux molécules comme le montrent les constantes de Michaelis (Km) qui soulignent l’affinité des transporteurs pour chacune de ces CA. Les Km du DAT et du NET pour la DA sont respectivement de 5.2 µM et 0.24 µM et les Km du DAT et du NET pour la NA sont respectivement de 17 µM et de 0.58 µM (Gu et al., 1994). Après la recapture de la NA par le NET (Fig. 16), la NA va être soit restockée dans une vésicule cellulaire, soit être dégradée en passant par la voie enzymatique utilisant la MAO.
Dans le SNC, la NA se lie à trois types de récepteurs, dits récepteurs adrénergiques α1, α2et β. Ces trois groupes de récepteurs se distinguent par leur pharmacologie et les voies de transduction qu’ils activent (Gnegy, 2012).
Les récepteurs de type α1 sont couplés à la protéine Gq et activent la PLC, entrainant l’activation de la PKC, soit via la voie de libération du Ca 2+ du RE ou via la voie de la DAG (Fig. 19).
Différents sous-types de ces récepteurs existent et se caractérisent notamment par leur taille et leur localisation tissulaire.
Les fonctions de la NA sont multiples, au niveau du SNC. Elle est impliquée dans la régulation de comportements tel que l’attention, la vigilance, l’éveil et les contrôles de faim et de satiété (Gu, 2002) et au niveau périphérique, par le système nerveux sympathique, elle régule le système cardio-vasculaire (Brodde et al., 2006).
La « transparisation »
Pourquoi un échantillon n’est pas transparent et comment le rendre transparent
Rendre un échantillon transparent est possible en permettant à la lumière de traverser celuici de façon homogène. Pour comprendre comment rendre transparent un échantillon, il faut d’abord savoir pourquoi il ne l’est pas. Un échantillon biologique n’est pas transparent car la lumière ne peut le traverser, ceci étant dû à trois raisons principales : 1) les différences d’indice de réfraction qui composentl’échantillon (Fig. 24 A), 2) la taille de l’échantillon (Fig. 24 A) et 3) les pigments qui bloquent le passage de la lumière (Fig. 24 B). Un échantillon biologique est constitué de nombreux éléments ayant des indices de réfraction hétérogènes. En effet, les protéines, les glucides, les lipides ou encore l’eau ont des indices de réfraction très variables allant de 1.33 pour l’eau jusqu’à des valeurs de 1.52-1.56 pour les protéines par exemple. Cette hétérogénéité des indices entraine la dispersion de la lumière, ce qui rend l’échantillon opaque (Fig. 24 A) (Ueda et al., 2020). Tous les protocoles de « transparisation » sont basés sur le même principe : homogénéiser les indices de réfraction des échantillons pour que la lumière ne se disperse plus dans l’échantillon. Des composés comme les pigments pouvant être présents dans la composition d’échantillons biologiques sont des éléments qui bloquent complètement le passage de la lumière (Fig. 24 B), il est donc indispensable de les éliminer avant l’homogénéisation. Diverses stratégies pour enlever ces pigments sont possibles telles l’utilisation de H2O2 qui blanchit de façon importante la pigmentation des hématies, par exemple pour l’œil une autre stratégie couplant l’utilisation d’H2O2à une exposition lumineuse (11watt/3000 kelvin) rend plus efficace la dépigmentation les cellules (Vigouroux et al., 2020).Une fois ces contraintes levées (Fig. 24 C), l’homogénéisation des échantillons devient possible et une fois réalisée la lumière peut les traverser, ils sont « transparisés» (Fig. 24 D).
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Table des matières
Nomenclature, abréviations et acronymes
Liste des figures
Production scientifique
Introduction
Chapitre I : Le sélénium et les sélénoprotéines
I. Le sélénium
1. La découverte du sélénium, ses dangers et son importance
2. Caractéristiques chimiques et biochimiques
3. Absorption et assimilation du sélénium dans l’organisme
4. Les principales formes biologiques
a. Les sélénobases
b. Les acides aminés séléniés
c. La sélénométhionine
d. La sélénocystéine
II. Les sélénoprotéines
1. La biosynthèse particulière des sélénoprotéines
a. L’ARNt [ser]sec
b. Le sélénosome
c. Le rôle de l’élément SECIS
d. Le sélénoprotéome
2. Localisations et fonctions des sélénoprotéines
a. Dans l’espace extracellulaire : GPX3, SELENOP
b. Dans la membrane plasmique : DIO1, DIO3, SELENOI, SELENOW
c. Dans le cytoplasme : GPX1, GPX2, GPX4,GPX6, TXRND1, TXRND3, MSRB1, SEPHS2, SELENOV, SELENOW
d. Dans la mitochondrie : GPX4, TXRND2, SELENOO
e. Dans le réticulum endoplasmique : DIO2, SELENOF, SELENOM, SELENOK, SELENOS, SELENON, SELENOT
f. Dans le noyau : GPX4, SELENOH, MSRB1
3. Focus sur la SELENOT
a. Sa découverte
b. Distribution tissulaire de la SELENOT chez l’animal et les conséquences de l’inactivation de son gène
c. Ses mécanismes fonctionnels connus
d. Son rôleneuroprotecteur
Chapitre II : Le système catécholaminergique
I. L’enzyme tyrosine hydroxylase point de départ de la synthèse des catécholamines
1. La dopamine
2. La noradrénaline
3. L’adrénaline
II. Tyrosine hydroxylase : du gène à la protéine
1. Le gène de la tyrosine hydroxylase
2. L’ARNm de la tyrosine hydroxylase
3. La protéine tyrosine hydroxylase
III. Localisation des catécholamines dans le SNC : de l’embryon au stade adulte
IV. Les divers rôles physiologiques des catécholamines
1. Le mésencéphale
a. L’area postrema (AP)
b. L’A5, le locus coeruleus (LC-A6) et l’A7
2. Le diencéphale
a. La substance grise périaqueducale (PAG-A10dc)
c. Regroupement cellulaire A11
3. Le télencéphale
a. La zona incerta (ZI-A13)
b. L’hypothalamus (Hyp-A12-A14-A15)
Chapitre III : L’imagerie tridimensionnelle: une nouvelle approche d’imagerie dans la recherche biologique
I. L’immunomarquage in toto
1. L’accessibilité des protéines d’intérêt
2. Le stade de développement influence l’immunomarquage in toto
II. La «transparisation »
1. Pourquoi un échantillon n’est pas transparent et comment le rendre transparent
2. Les familles de protocoles de « transparisation » et les critères de sélections
3. La « transparisation » par solvants organiques
4. Quelques caractéristiques de différents protocoles de « transparisation » par solvants organiques
5. Les multiples domaines d’application de l’imagerie tridimensionnelle
III. Microscopie pour échantillons « transparisés » : la feuille de lumière un outil particulièrement adapté
IV. L’imagerie tridimensionnelle, sa visualisation et ses analyses
Objectifs de thèse
Résultats
Premier articleThree-dimensional mapping of tyrosine hydroxylase in the transparent brain and
adrenal of prenatal and pre-weaning mice : Comprehensive methodological
flowchart and quantitative aspects of 3D mapping
Deuxième article
SELENOT deficiency in the mouse brain impacts catecholaminergic neuron
density: an immunohistochemical, in situ hybridization and 3D light-sheet imaging study
Résultats non publiés
Impact de la SELENOT sur divers comportements chez la souris
Discussion
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques
