La jonction dermo-épidermique (JDE)
Les membranes basales (MB) sont des structures très spécialisées qui se trouvent à l’interface entre un tissu conjonctif et des cellules épithéliales. La MB cutanée se situe entre l’épiderme et le derme et est connue comme jonction dermo-épidermique (JDE). La JDE sépare ces deux compartiments en assurant l’adhésion et une interface dynamique entre le derme et l’épiderme. Elle garantit, par conséquent, l’intégrité structurale générale de la peau. Parallèlement, cette structure contrôle le trafic moléculaire entre le derme et l’épiderme en permettant la migration de cellules telles que les mélanocytes (Haass et al., 2005), les cellules de Langherans (Aiba et al., 1993; Price et al., 1997) ou encore les lymphocytes (Warfel et Hull, 1984) et les cellules tumorales (Li et al., 2001; Tsuji et al., 2002). La JDE est un complexe de protéines étroitement associées les unes aux autres (Ghohestani et al., 2001; Hashmi et Marinkovich, 2011) (Fig. 3). Elle est constituée essentiellement de quatre régions différentes : (1) la membrane plasmique des kératinocytes basaux riche en hémidesmosomes associés aux filaments de kératine de type 5 et 14; deux régions, qui doivent leur nom à leur aspect visible en microscopie électronique : (2) la lamina lucida et la (3) lamina densa cette dernière est liée au filament d’ancrage; et enfin (4) la lamina sub basale, constituée par les fibrilles dermiques. De nombreuses protéines sont présentes dans ce complexe, notamment la laminine V et VI au niveau de la lamina lucida, le nidogène et le collagène de type IV au niveau de la lamina densa, et le collagène de type VII constituant les fibrilles d’ancrage de la lamina subbasale. Une partie de ces protéines, à savoir les laminines V et VI, et le collagène de type IV est synthétisée par les kératinocytes basaux alors que le collagène de type VII, le nidogène et la fibronectine sont synthétisés à partir des fibroblastes du derme papillaire.
L’épiderme
L’épiderme (du grec epi-sur et dermis-peau), la couche la plus externe de la peau, est un épithélium pavimenteux stratifié kératinisé composé essentiellement de cellules appelées kératinocytes. Au sein de l’épiderme d’autres types cellulaires sont également présents, tels que les mélanocytes, les cellules de Merkel, les cellules de Langherans et occasionnellement les cellules T cytotoxiques CD8+ (Nestle et al., 2009). L’épiderme, dont l’épaisseur peut varier de 60 à 120 µm, est constitué de quatre couches cellulaires superposées, caractérisées par leur position, leur morphologie et leur degré de différenciation : la couche basale ou stratum basale (SB), la couche épineuse ou stratum spinosum (SP), la couche granuleuse ou stratum granulosum (SG) et la couche cornée ou stratum corneum (SC) (Fig. 4). Il est admis que les kératinocytes migrent de la couche basale vers la couche épineuse puis vers la couche granuleuse, en changeant de forme et en synthétisant des fibres de kératine spécifiques, des protéines telles que la filaggrine et l’involucrine et des lipides. Les kératinocytes deviennent, au cours du dernier stade de différenciation, les cellules de la couche cornée qui est la couche superficielle de la peau. Ce programme de différenciation a une durée d’environ 30 jours.
Les cellules de l’épiderme
Les kératinocytes
Les kératinocytes sont le type cellulaire le plus important au sein de l’épiderme, représentant environ 90% de la population cellulaire. Ces cellules synthétisent la kératine , un type de filament intermédiaire, qui en s’associant aux filaments d’actine et aux microtubules, forme le cytosquelette intracellulaire. En se différenciant progressivement, les kératinocytes migrent de la couche basale jusqu’à la couchée cornée, où ils sont libérés dans l’environnement, suite au processus de desquamation. Ils jouent un rôle central dans la fonction protectrice de l’épiderme.
Les mélanocytes
Les mélanocytes sont responsables de la pigmentation de la peau, grâce à leur capacité à synthétiser la mélanine. Au sein de la peau deux types différents de mélanine sont produits : l’eumélanine, de couleur noire/marron et la phaeomélanine, de couleur jaune/rouge. Elles sont impliquées dans l’une des fonctions majeures de la peau, la fonction photo-protectrice (Brenner et Healing, 2008). L’exposition aux rayons ultraviolets peut susciter un photo-endommagement des cellules épidermiques et le développement de cancers cutanés. La mélanine assure la protection du matériel génétique des kératinocytes suite à son transfert via des structures filamenteuses appelées les dendrites.
Les cellules de Langerhans
Les cellules de Langerhans sont des cellules dendritiques qui, avec les macrophages du derme, font partie du système phagocytaire mononucléaire de l’épiderme. Elles sont capables de phagocytose, mais aussi d’apprêter et de présenter un antigène exogène. En migrant vers les ganglions lymphatiques, elles vont interagir avec les lymphocytes et d’activer la réponse immunitaire (Romani et al., 2010).
Les cellules de Merkel
Les cellules de Merkel sont les cellules minoritaires de l’épiderme (1% environ). Elles se trouvent principalement au niveau de la couche basale. Ces cellules sont capables de produire de nombreuses protéines neuronales et semblent être impliquées dans la perception somatosensorielle (Maricich et al., 2009).
Les couches épidermiques
La couche basale ou stratum basale
La couche basale, ou couche germinative, est une monocouche attachée au derme grâce à la JDE. Elle est constituée par des kératinocytes basaux, cellules de forme cubique, mitotiquement actives et indifférenciées. Cette division, marquant l’activation d’un programme de différenciation élaboré, assure le renouvellement systématique de l’épiderme. Pendant des années, la division mitotique au sein de la couche basale a été vue comme un processus symétrique (Fig. 5a) au cours duquel une cellule staminale donnait naissance à une cellule à amplification transitoire (TA), cellule qui pouvait se diviser plusieurs fois avant de se différencier et migrer vers les couches supérieures (Potten, 1974; Barradon et Green, 1987; Mackenzie, 1997). À l’appui de cette hypothèse, il a été montré que les cellules, nommées cellules « holoclones », caractérisées par une forte présence d’intégrine bêta-1 étaient capables de se diviser indéfiniment. Inversement, les cellules avec des niveaux d’intégrine bêta-1 beaucoup moins importants, et nommées cellules « paraclones », après une quinzaine de cycles cellulaires, se différenciaient en cellules de la couche épineuse (Jones et al., 1995; Watt et al., 1982). Des travaux plus récents (Lechler et Fuchs, 2005; Clayton et al., 2007) ont suggéré l’existence d’une division asymétrique par laquelle une cellule staminale peut générer directement une cellule différenciée, voire une cellule épineuse (Fig. 5b). Lechler et Fuchs (2005) ont observé chez la souris, que des cellules de la couche basale en cours de mitose, peuvent changer l’orientation de leur fuseau mitotique, de façon perpendiculaire, afin de subir une division asymétrique. Cependant seulement 70 % des cellules basales seraient capables d’effectuer ce type de division, ce qui suggère que les deux modèles, divisions symétrique et asymétrique, peuvent coexister au sein de l’épiderme. Au sein du SB, les kératinocytes sont caractérisés par la production des filaments de kératine 5 et 14, marqueurs spécifiques de la couche basale.
La couche épineuse ou stratum spinosum
La couche épineuse est composée de 5 à 10 assises cellulaires. Elle doit son nom aux nombreuses « épines » visibles en microscopie optique sur coupe histologique. Ce sont en effet les desmosomes, à partir desquels se développent les filaments intermédiaires de kératine, qui assurent cohésion et résistance mécanique à tout l’épiderme. Dès qu’un kératinocyte rentre dans la couche épineuse, il cesse de se diviser et commence son programme de différenciation. A ce stade, les kératinocytes produisent des fibres de kératine de type 1 et 10 et subissent des modifications morphologiques en s’élaRG-Issant et s’aplatissant graduellement.
La couche granuleuse ou stratum granulosum
La couche granuleuse, dernière couche vivante de l’épiderme, est composée de 2 à 5 assises de cellules. Les kératinocytes appartenant à cette couche doivent leur nom à une forte présence de grains de kératohyaline (agrégats de pro-filaggrine) au niveau du cytoplasme. Les kératinocytes de la couche granuleuse ont une forme allongée et aplatie. Ils sont caractérisés par la production de nombreuses protéines marqueurs de la différenciation terminale, tels que la loricrine et la profilaggrine (Fig. 6). Ils sont également riches en corps lamellaires (appelés aussi kératinosomes ou corps d’Odland), de structures tubulo-vésiculaires d’origine golgienne qui secrètent leur contenu protéique et lipidique par exocytose au niveau de la couche cornée.
La couche cornée ou stratum corneum
La couche cornée est la couche la plus superficielle de l’épiderme. Elle est constituée de 5 à 30 assises cellulaires. Après avoir achevé leur migration jusqu’à cette zone de l’épiderme, les kératinocytes deviennent des cellules mortes anucléées, les cornéocytes, d’environ 30 µm de long et 0.5 µm de large. Ces cellules représentent le dernier stade de différenciation épidermique. Leur membrane plasmique est remplacée par une coque rigide et insoluble, l’enveloppe cornée, et le cytoplasme est constitué principalement d’une matrice fibreuse riche en kératine et filaggrine. Les cornéocytes sont ensuite éliminés par le processus de desquamation et remplacés continuellement par des cellules de la couche inférieure. Selon l’organisation cellulaire, trois régions sont distinguées au sein de la couche cornée : (1) une partie plus interne, le stratum compactum, caractérisée par la présence de cornéocytes très cohésifs reliés par la cornédesmosine, et où la filaggrine est présente; (2) une zone intermédiaire au niveau de laquelle la filaggrine est dégradée en Facteur Naturel d’Hydratation (FNH) et (3) une couche plus superficielle, le stratum disjonctum, où la cornédesmosine est hydrolysée permettant le renouvellement de l’épiderme par l’élimination constante des cornéocytes.
La couche cornée a longtemps été considérée comme une couche cellulaire inerte, non fonctionnelle. En 1954, Rothman, dans un ouvrage intitulé « Physiology and Biochemistry of Skin », définissait le stratum corneum comme « une couche amorphe, une masse flasque de fibres de kératine» (« basketweave statum corneum »). Dans les années 70, avec le développement des techniques de fixation à froid des échantillons (Menton et Eisen, 1971, Odland et Reed, 1974; Elias, 1975; Elias et al., 1979) une autre vision de la couche cornée prend forme : elle est décrite avec une définition encore largement utilisée de nos jours, comme une structure à « briques et mortier », concept crée par le Pr. Elias. Les briques sont les cornéocytes, remplis d’une masse hydrophile de filaments de kératine et entourés par une matrice extracellulaire riche en lipides, le mortier (Fig. 7a). Les lipides intercornéocytaires les plus représentés sont les céramides (Fig. 8), le cholestérol et les acides gras constituant respectivement 50 %, 25% et 10% de la masse lipidique totale (Wertz et Norlen, 2003). Les précurseurs de ces lipides sont emmagasinés dans les corps lamellaires au niveau de la couche granuleuse. Il s’agit de glycosphingolipides, de stérols libres et de phospholipides. Ces vésicules sécrètent ensuite leur contenu dans les espaces extracellulaires de la couche cornée (Fig. 7b). Une fois excrétés dans le stratum corneum, ces lipides polaires sont modifiés par l’action d’enzymes spécifiques en lipides non polaires et sont organisés en structures lamellaires intercellulaires. Les glycolipides sont ainsi convertis en céramides et les phospholipides en acides gras libres. De nature hydrophobe, les lipides intercornécytaires limitent la perte d’eau trans-épidermique (Trans Epidermal Water Loss, TEWL), qui correspond à la perte d’eau par évaporation au sein de l’épiderme (Grubauer et al., 1989; Denda et al., 1998). Cette fonction est accomplie par le FNH, un mélange d’acides aminés hygroscopiques dérivant de la dégradation de la filaggrine, tels que l’acide urocanique et l’acide carboxylique pyrrolidone. Ces molécules, avec l’acide lactique, l’urée et le citrate maintiennent l’hydratation de la peau en absorbant l’eau à travers la couche cornée.
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Table des matières
Chapitre Premier : Introduction
I Généralités
I.I Structure de la peau
I.I.1 L’hypoderme
I.I.2 Le derme
I.I.3 La jonction dermo-épidermique (JDE)
I.I.4 L’épiderme
I.I.4.1 Les cellules de l’épiderme
a) Les kératinocytes
b) Les mélanocytes
c) Les cellules de Langerhans
d) Les cellules de Merkel
I.I.4.2 Les couches épidermiques
a) La couche basale ou stratum basale
b) La couche épineuse ou stratum spinosum
c) La couche granuleuse ou stratum granulosum
d) La couche cornée ou stratum corneum
I.I.4.3 Les jonctions cellulaires au sein de l’épiderme
a) Les jonctions adhérentes (adherent junctions)
b) Les jonctions communicantes (gap junctions)
c) Les jonctions serrées (tight junctions)
d) Les desmosomes
II Les propriétés « barrières » de la peau et la défense innée
II.I La flore bactérienne cutanée
II.II L’immunité cutanée innée
II.II.1 Signalisation via les récepteurs toll-like
II.II.1.1 Structure des TLRs et diversité de leurs ligands
II.II.1.2 Les voies de signalisation des TLRs
II.II.1.2 Expression des TLRs dans les kératinocytes
II.II.2 Signalisation via les récepteurs NOD-like (NLRs)
II.II.3 Les peptides antimicrobiens
II.II.3.1 Les différents types de PAMs
a) Généralités
b) Les défensines
c) Les cathélicidines
d) La RNase 7
e) S100A7 (psoriasine)
f) Autres molécules à activité antimicrobienne
II.II.3.2 Mécanismes d’action des PAMs
II.II.4 Les cytokines
II.II.4.1 La famille des IL-1
II.II.4.2 La famille des IL-6
II.II.4.3 Les TNF
III Dermo-cosmétique et renforcement de la barrière cutanée
III.I Les polysaccharides et protéoglycannes végétaux
III.II Le Rhamnogalacturonane II (RG-II)
IV Objectifs de la thèse
Chapitre Deuxième : Matériel et Méthodes
I Préparation des glycomolécules
II Préparation et culture des explants de peau humaine
III Préparation des souches bactériennes
IV Stimulation ex-vivo des explants
V Analyse du profil d’expression des gènes de la défense innée
V.I Microdissection laser
V.II Extraction de l’ARN à partir des tissus microdissequés
V.III Extraction de l’ARN à partir de tranche entière d’explants
V.IV Rétrotranscription et PCR quantitative en temps réel
V.V Analyses statistiques des données de qPCR
VI Analyses microscopiques
VI.I Microscopie optique : analyses morphologiques et immunofluorescence
VI.II Microscopie électronique à transmission
VI.II.1 Fixation chimique
VI.II.2 Congélations haute pression (HPF) et substitution à froid
VI.II.3 Analyses ultrastructurales et Immunogold
VII Test ELISA
Chapitre Troisième : Résultats
I Analyse d’expression génique au sein de l’épiderme et caractéristiques ultrastructurales des explants
Publication n.° 1 : « Isolation of human epidermal layers by laser capture microdissection: application to the analysis of gene expression by quantitative real-time PCR »
Résultats complémentaires : analyse ultrastructurale de l’explant et immunolocalisation de protéines d’intérêt
II Impact des bactéries S. epidermidis, S. aureus et P. fluorescens sur l’immunité cutanée innée / Apport du modèle explant
Publication n.° 2 : “ Human skin explant: a model to study the interaction between the epidermal cells and the cutaneous microbiota ”
Résultats complémentaires : impact de S. aureus sur la physiologie de l’explant
III Effet de biomolécules de nature polysaccharidique sur la défense cutanée innée en lien avec le microbiome
III.I Biomolécule végétale : polysaccharide pectique, le rhamnogalacturonane II
III.II Biomolécule polysaccharidique riche en rhamnose : le Téflose
Chapitre Quatrième : Discussion et Perspectives
I Microdissection laser des couches épidermiques d’explants de peau humaine : application à l’étude d’expression génique par PCR en temps réel
II Expression des gènes de défense et de l’inflammation en lien avec le microbiome cutané
III Impact de biomolécules sur les mécanismes de défense cutanée
Références bibliographiques
Annexes
