Le colza (Brassica napus L.), de l’ordre des Rhoeadales, appartient à la famille des Brassicacées (Crucifères). Il est doté d’un double génome puisqu’il est issu du croissement naturel d’un chou (B. oleracea L.) et d’une navette (B. campestris L.). Il s’agit d’une plante herbacée annuelle pouvant atteindre plus de deux mètres de haut. Deux types de colza sont différenciés, le colza d’hiver et le colza de printemps, qui effectuent respectivement leur cycle de développement en 250-310 jours et 120-150 jours.
Cette oléagineuse est divisée en 4 « familles » de colza présentant des débouchés agroalimentaires et industriels spécifiques en fonction de leur richesse en certains acides gras . En effet, les fruits du colza sont des siliques renfermant de petites graines ex albuminées à cotylédons riches en lipides (environ 45%) qui sont utilisées pour l’essentiel à la production d’huile de table . L’extraction de cette huile fournit un sous-produit, le tourteau de colza, qui est une source de protéines intéressante pour l’alimentation animale. Les dérivés d’huile de colza sont également valorisés dans des usages autres qu’alimentaires, tels que des bio lubrifiants, des solvants, des produits cosmétiques , ou des agents protecteurs du bois contre les attaques de champignons et d’insectes (ASAM ). Actuellement, une des principales applications dans le domaine industriel est le diester, un biocarburant pour moteur diesel. Le gouvernement français a décidé que les niveaux d’incorporation de biocarburants dans le carburant pétrolier classique devaient atteindre 7% en 2010 alors que les accords de Kyoto imposent 5,75%. En 2005, environ 450 000 hectares de colza ont été cultivés pour le diester soit 35% des surfaces de colza cultivé en France. Avec des besoins 2,5 fois plus élevés en 2009, les surfaces de colza dédiées au diester devraient atteindre 1 million d’hectares.
Le colza est une culture largement répandue dans le monde, principalement dans les zones tempérées fraîches. En 2007, la production mondiale de graines de colza était d’environ 47 millions de tonnes de graines permettant de produire 18 millions de tonnes d’huile et environ 27 millions de tonnes de tourteaux. Les principaux producteurs sont l’Union Européenne, le Canada, les Etats-Unis, l’Australie, la Chine et l’Inde . En 2007, l’Union Européenne produisait le tiers du colza mondial soit environ 16 millions de tonnes de graines. En France, la superficie cultivée en colza a doublée entre 1994 et 2007 contrairement aux autres plantes oléagineuses (soja et tournesol) pour lesquelles les superficies de culture ont eu tendance à diminuer . Avec 1,4 millions d’hectares en 2006, la production française était de 4,4 millions de tonnes de graines avec des rendements moyens de 29,1 quintaux.ha-1 en moyenne. Depuis ces dix dernières années, le potentiel de rendement a gagné 2,5% par an. Cette augmentation significative des rendements est essentiellement due au progrès génétique (sélection variétale), à l’amélioration des techniques agricoles et des modalités d’apport des intrants (fertilisants et produits phytosanitaires).
GESTION DE L’AZOTE AU COURS DU DÉVELOPPEMENT DU COLZA D’HIVER
L’absorption de l’azote et la fertilisation azotée au cours du développement du colza d’hiver
L’azote est un élément essentiel au développement des plantes. Les deux principales sources d’azote présentes dans le sol sont des formes minérales, le nitrate et l’ammonium. Avec des concentrations 10 à 1000 fois plus élevées que l’ammonium, le nitrate est considéré comme la source d’azote minéral majoritaire dans les sols bien aérés. La disponibilité en azote du sol est un facteur important dans le cycle de développement du colza d’hiver lequel est divisé en sept étapes: germination, production de feuilles, extension de la tige (montaison), développement des bourgeons floraux, floraison, développement des siliques et formation des graines (Sylvester-Bradley et Makepeace, 1984).
Du semis au stade reprise de croissance
Le colza d’hiver est semé fin août – début septembre. Une implantation optimale correspond à 40 à 80 graines par m², soit une quantité de semences comprise entre 2 et 4 kg.ha-1. A la levée, le colza développe d’abord ses deux feuilles cotylédonaires puis une vingtaine de feuilles dites « vraies » formant la rosette . Dans le même temps, cette plante élabore un système radiculaire en pivot, où elle accumule des réserves organiques qui seront utilisées lors de son développement ultérieur. A la fin de l’automne, la croissance est progressivement ralentie. Le zéro végétatif du colza étant de 5°C, la croissance est presque stoppée pendant la période hivernale au cours de laquelle le colza peut supporter des températures inférieures à -20°C (Merrien et Pouzet, 1988). Le froid est justement un facteur important du cycle de développement de cette plante, et plus spécifiquement, dans l’étape d’initiation florale (vernalisation). La durée minimale de la vernalisation est d’autant plus faible que la température est basse, que l’héméropériode est longue et que les plantes sont âgées (Leterme, 1988). Durant cette période automno hivernale, le colza présente un fort potentiel de stockage de l’azote. Ainsi, la directive 91/676/CEE du 31 décembre 1991 dite directive « nitrate » (transposée en droit français par le décret n°93-1038 du 27 août 1993) interdit l’apport de fertilisants azotés minéraux ou uréiques de synthèse du 1er septembre au 15 janvier en zone vulnérable. Deux raisons invoquées par le Centre Technique Interprofessionnel des Oléagineux Métropolitains (CETIOM) permettent d’expliquer cette restriction :
• l’absorption d’intrants azotés peut conduire à une augmentation de la surface foliaire sans pour autant améliorer le rendement final (Colnenne et al., 1998),
• le faible coefficient d’utilisation de l’azote apporté, en comparaison avec celui des apports de printemps, peut entraîner un lessivage supplémentaire du nitrate durant la période automno-hivernale via la chute des feuilles de la rosette encore riches en azote (teneur en azote pouvant atteindre 4,5% de la matière sèche ; Dejoux et al., 2000).
De la reprise de croissance jusqu’au stade fin de montaison
Au retour des températures douces, à la fin de l’hiver, il y a reprise de la croissance et de nouvelles feuilles apparaissent. Cependant, cette reprise de végétation dépend plus de la date du semis que de la température (Tittonel et al., 1988). Cette étape, qui se caractérise par une augmentation importante de la surface foliaire, se prolonge jusqu’au début de la floraison. Parallèlement, la tige commence à s’allonger (montaison), puis émet de nombreuses ramifications. La montaison, qui est corrélée au stade de développement de la fleur, est favorisée par les jours longs. A l’extrémité de la tige principale, les boutons floraux s’épanouissent en grappes, du bas vers le haut des ramifications de la plante, à partir du mois d’avril .
L’utilisation d’un marquage continu à l’azote 15 en conditions contrôlées, a permis de suivre l’absorption cumulée de 15NO3- de la reprise de végétation jusqu’à la fin du remplissage des siliques (Rossato et al., 2001). Cette étude montre une forte absorption de l’azote jusqu’au début de floraison indiquant que cette période de croissance est associée à une demande importante de l’élément azote. Une fertilisation azotée de printemps est donc préconisée entre la reprise de végétation et le début de montaison pour compenser les quantités insuffisantes de nitrate du sol et assurer la croissance optimale du colza. Les apports totaux sont en général compris entre 140 à 180 kg de N par ha et par an. L’essentiel de l’azote minéral absorbé est alloué aux parties aériennes (tige (36%), feuilles (30%) et inflorescences (16,5%)) et au pivot (10% ; Rossato et al., 2001). Cet apport, primordial lors de la période « reprise de végétationmontaison », permet d’atteindre un fort indice foliaire à la floraison. De plus, une quantité non négligeable d’azote endogène est remobilisée des feuilles matures au profit de la tige (51%), des inflorescences (33%) et du pivot (9%).
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Table des matières
CHAPITRE I : INTRODUCTION GÉNÉRALE
CHAPITRE II : ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
I. GESTION DE L’AZOTE AU COURS DU DÉVELOPPEMENT DU COLZA D’HIVER
I.1 L’absorption de l’azote et la fertilisation azotée au cours du développement du colza d’hiver
I.1.1 Du semis au stade reprise de croissance
I.1.2 De la reprise de croissance jusqu’au stade fin de montaison
I.1.3 Du stade floraison jusqu’à la récolte
I.2 Assimilation, formes de réserves et mobilisation de l’azote endogène
I.3 Voies d’amélioration de l’EUA : des premières pistes encourageantes
II. REMOBILISATION DE L’AZOTE ET SÉNESCENCE FOLIAIRE
II.1 Définition et principales étapes du processus de sénescence foliaire
II.1.1 Les manifestations de la sénescence au niveau cellulaire
II.1.2 Les manifestations de la sénescence au sein de chaque organite
II.1.3 Les manifestations de la sénescence au niveau moléculaire
II.2 Modifications du métabolisme azoté associé à la sénescence : un préalable au recyclage de l’azote endogène
II.3 Les protéines impliquées dans le processus de protéolyse
II.3.1 Les voies de dégradation des protéines
II.3.2 Les protéases
III. RÉGULATION DE LA REMOBILISATION DE L’AZOTE ASSOCIÉE Á LA SÉNESCENCE FOLIAIRE
III.1 Incidence des facteurs environnementaux
III.2 Le rôle des phytohormones
III.3 Le stress oxydatif
III.4 Action des sucres
III.5 Implication des inhibiteurs de protéases
III.6 Facteurs de transcription
IV. CONCLUSION ET OBJECTIFS DE RECHERCHE
CHAPITRE III : MATÉRIELS & MÉTHODES
I. CONDITIONS DE CULTURE ET PROTOCOLES EXPÉRIMENTAUX
I.1 Conditions de culture en milieu contrôlé
I.2 Protocoles expérimentaux
I.2.1 Dispositifs expérimentaux mis en place pour l’étude de l’implication d’un inhibiteur de protéases, BnD22, dans la régulation de la sénescence foliaire (Chapitre IV)
I.2.2 Dispositif expérimental mis en place pour l’étude des modifications protéomiques associées au recyclage de l’azote foliaire chez le colza soumis à différents niveaux de fertilisation azoté (Chapitre V)
I.2.3 Dispositif expérimental mis en place pour l’étude physiologique et biochimique des phases ultimes du développement d’une feuille de colza (Chapitre VI)
II. DÉTERMINATION DE L’ÉTAT PHYSIOLOGIQUE DE LA PLANTE
II.1 Mesure de la biomasse et de la surface foliaire
II.2 Mesure de la teneur relative en chlorophylles
II.3 Mesure de l’activité photosynthétique
III. MÉTHODES D’ANALYSES ÉLÉMENTAIRES (AZOTE ET CARBONE) ET BIOCHIMIQUES
III.1 Détermination des teneurs carbone (C) et azote (N) total et des flux d’azote remobilisé
III.1.1 Dosage du carbone total et de l’azote total et analyse du rapport isotopique 15N/14N
III.1.2 Calcul des quantités d’azote total et du 15N
III.1.3 Méthodes de calcul des flux azotés
III.2 Méthode d’analyses des acides aminés
IV. MÉTHODES D’ANALYSES PROTÉOMIQUES
IV.1 Méthodes d’analyses quantitatives et qualitatives des protéines foliaires
IV.1.1 Extraction et dosage des protéines totales et solubles
IV.1.2 Techniques d’électrophorèse mono-dimensionnelle (SDS-PAGE)
IV.1.3 Mise au point de technique d’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE)
IV.1.3.1 Purification des protéines totales
IV.1.3.2 Solubilisation des protéines et première dimension
IV.1.3.3 Deuxième dimension (SDS-PAGE)
IV.1.4 Analyse des gels
IV.1.5 Identification des protéines d’intérêt par ESI-LC MS/MS
IV.1.6 Identification des protéines par microséquençage N-terminal des protéines
IV.1.7 Transfert sur membrane PVDF (« Western blotting ») et immunodétection
IV.1.7.1 Transfert électrophorétique des protéines sur PVDF (« western blotting »)
IV.1.7.2 Révélation immunologique de la protéine
IV.2 Détermination des activités protéolytiques et anti-protéolytiques
IV.2.1 Détermination des activités protéolytiques
IV.2.1.1 Analyse des activités protéolytiques par azocaséine
IV.2.1.1 Analyse des activités protéolytiques sur gel SDS-PAGE
IV.2.2 Détermination des activités anti-protéolytiques sur gel SDS-PAGE
V. MÉTHODES D’ANALYSES TRANSCRIPTOMIQUES
V.1 Extraction des ARNs totaux
V.2 Analyse de l’expression des gènes
V.2.1 Analyse de l’expression des gènes en PCR semi-quantitative
V.2.2 Analyse de l’expression des gènes en PCR quantitative (Q-PCR)
V.2.2.1 Principe de la Q-PCR
V.2.2.1 Détermination et validation des amorces utilisées en Q-PCR
V.2.2.1 Quantification relative de l’expression des gènes cibles
V.3 Utilisation de l’indicateur moléculaire de sénescence SAG12/Cab
V.3.1 Détermination de la date théorique d’entrée en sénescence
V.3.2 Détermination du dernier rang foliaire sénescent et de la vitesse de la progression de la sénescence foliaire
CHAPITRE IV : IMPLICATION D’UN INHIBITEUR DE PROTÉASES, BnD22, DANS LA RÉGULATION DE LA SÉNESCENCE FOLIAIRE
CHAPITRE V : CONCLUSION
