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Saccharothrix algeriensis0
Position taxonomique et caractéristiques
Isolée en 1992 à partir d’un échantillon de sol prélevé d’une oasis du Sud-Ouest algérien (à Adrar), Saccharothrix algeriensis a été identifiée et classée dans le genre Nocardiopsis (Boudjella, 1994). Elle a été reclassée par la suite dans le genre Saccharothrix dont elle possède la micromorphologie typique. Suite à une analyse phylogénétique (séquençage de l’ADNr 16S et taux d’hybridation ADN-ADN) suivie d’une taxonomie numérique, incluant 77 tests physiologiques, des différences ont été mises en évidence entre S. algeriensis et les autres espèces connues du genre. Elle fut ainsi nommée Saccharothrix algeriensis par Zitouni et al. en 2004 et déposée dans deux collections mondiales : Leibniz-Institut DSMZ (« Leibniz-Institut Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ») et ARC culture (« Agricultural Research Service Culture ») sous les numéros d’accessions DSM 44581 et NRRL B-24137. Le numéro d’accession de la séquence ARN 16S est le AY054972 (Zitouni et al., 2004 b). La position taxonomique de Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137 est indiquée dans le Tableau 1.2.
Activités biologiques de Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137
S. algeriensis présente des activités biologiques contre les bactéries à Gram-positif, à Gram négatif, les champignons filamenteux et les levures. Les résultats sont regroupés dans le Tableau 1.5. L’activité bactéricide est moins marquée contre les bactéries à Gram négatif (à l’exception de Klebsiella pneumoniae) que celles à Gram positif (à l’exception d’Enterococcus faecalis). Toutefois, la seule bactérie testée montrant une absence totale de sensibilité à S. algeriensis est Pseudomonas aeruginosa. L’activité antifongique de S. algeriensis est importante contre les champignons filamenteux phytopathogènes (tels que ceux du genre Fusarium, notamment l’espèce Fusarium oxysporum (Merrouche et al., 2017)) et toxinogènes (tels que Mucor ramannianus), et moyenne contre les levures (Saccharomyces cerevisiae et Candida albicans) (Zitouni, 1995).
Cette activité antifongique a été également valorisée dans le biocontrôle direct contre l’agent phytopathogène de la vigne Botrytis cinerea. En effet, S. algeriensis est capable de coloniser les cellules racinaires de la plante et de réduire le nombre de feuilles infectées par Botrytis cinerea (Muzammil, 2012 ; Compant et al., 2013 ; Muzammil et al., 2014).
Ces activités biologiques sont dues à des composés secrétés par S. algeriensis identifiés comme étant des dithiolopyrrolones, qui font l’objet du paragraphe suivant.
Dithiolopyrrolones sécrétés par Saccharothrix algeriensis
Les travaux réalisés par Zitouni en 1995 ont mis en évidence la présence dans le filtrat de culture de S. algeriensis de composés extractibles par le dichlorométhane. Par séparation sur chromatographie sur couche mince (CCM) apparaissaient deux taches de couleur jaune vif. L’analyse des composés par spectroscopie (UV-visible, IR, RMN et MS) a révélé la présence de six produits appartenant à la famille des dithiolopyrrolones : la thiolutine, l’isobutyryl-pyrrothine, le butanoyl-pyrrothine, la benzoyl-pyrrothine, la sénécioyl-pyrrothine et la tigloyl-pyrrothine (Lamari et al., 2002) (Figure 1.3.B).
S. algeriensis est actuellement le seul taxon de son genre capable de produire des dithiolopyrrolones. Sur milieu ISP2, la thiolutine est le dithiolopyrrolone majoritairement produit par S. algeriensis (Bouras et al., 2008 ; Merrouche et al., 2011). Toutefois, cette dernière est capable de biosynthétiser différents dérivés à partir d’acides organiques tels que l’acide valérique, l’acide sorbique et benzoïque (Bouras et al., 2008).
Source de production des dithiolopyrrolones
Synthèse chimique
Trois dérivés de dithiolopyrrolones : la thiolutine, l’auréothricine et l’holomycine ont été synthétisées totalement par voie chimique dès 1962 par Schmidt et Geiger. Depuis différentes approches ont été utilisées pour la synthèse chimique totale des dithiolopyrrolones mais les voies de synthèse utilisées restaient complexes (7 étapes au moins). Des voies de synthèse simplifiées permettant par ailleurs de multiplier les composés synthétisés ont été aussi rapportées. À titre d’exemple, Hjelmgaard et al. (2007) ont réussi à proposer une voie de synthèse en six étapes permettant de synthétiser différentes dithiolopyrrolones (R1= H, R2 variable) grâce à l’acylation de l’intermédiaire holothine à l’aide de chlorures d’acyle. En outre, Li et al.(2007) ont élaboré une voie de synthèse en six étapes qui permet de diversifier à la fois les radicaux R1 et R2 fixés sur le noyau pyrrolinodithiole mais cette voie nécessite l’usage de composés toxiques et polluants tels que l’acétate de mercure (Hjelmgaard & Nielsen, 2007 ; Li et al., 2007 ; Li et al., 2014).
Au sein de l’équipe de chimie du LGC, la synthèse de la pyrrothine, a été réalisée, par adaptation du protocole décrit par Hjelmgaard et al. (2007) pour la synthèse de l’holothine et de ses dérivés dithiolopyrrolones, suivant le schéma présenté sur la Figure 1.4. Le groupement méthyle porté par l’azote cyclique est introduit lors de l’étape (b) en remplaçant la p-méthoxybenzylamine par de la méthylamine (Li et al., 2007). Finalement, le groupement amide de la trifluoroacétyl-pyrrothine (composé 5) est hydrolysé à reflux dans le méthanol en présence d’HCl aqueux concentré (étape f) pour permettre l’obtention de la pyrrothine (composé 6) qui est récupérée par filtration sous forme d’une poudre de couleur orangé- brun. Le rendement global est de 3,53 % (Chorin, 2009).
Intérêt des dithiolopyrrolones
Utilisation dans l’agriculture
Nombreuses sont les utilisations des dithiolopyrrolones dans le domaine agricole, comme en témoigne le nombre de dépôts de brevets déposés sur les effets des dérivés biocides notamment la thiolutine, les thiomarinols et l’holomycine (www.uspto.gov/patft).
Le Tableau 1.8 regroupe les principaux effets de la thiolutine sur des agents phytopathogènes attaquant diverses variétés culturales.
En plus de ses propriétés antifongiques contre des mycètes tels que Venturia inaequalis, Puccinia recondita, Pyriculeria oryzea, la thiolutine possède des propriétés herbicides contre Lemona minor, une mauvaise herbe inhibitrice de la croissance de certaines plantes (Dell et al., 1992). Il est intéressant aussi de noter l’activité larvicide de ce dérivé, comme celle des xénorhabdines, contre Lucilia sericata, une larve nuisible à certaines cultures (Nickell & Finlay, 1954).
Utilisation dans le domaine médical
Les dérivés des dithiolopyrrolones et surtout la thiolutine, ont fait l’objet de plusieurs études quant à leurs propriétés thérapeutiques dans le traitement des allergies et de la chimioprévention.
Par ailleurs, la thiolutine possède des propriétés antitumorales, à l’instar d’autres dérivés dithiolopyrrolones, grâce à son mode d’action inhibant l’intégrine αυβ3, une protéine essentielle à la croissance des tumeurs et impliquée dans l’adhésion des cellules endothéliales des veines ombilicales (HEVC : Human Umbilical Vein Endothelial Cell).
D’autres propriétés de la thiolutine ont été mises en évidence, notamment son activité antiangiogénique (Minamiguchi et al., 2001), et son rôle préventif contre les effets des molécules cancérigènes sur les cellules épithéliales et celles du colon, de la prostate, de la peau, des reins, du cerveau et des poumons (Webster et al., 2000).
Par ailleurs, la thiomarinole a montré une activité plus forte que celle de la Mupirocine sur le MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) utilisée auparavant dans les hôpitaux (Murphy et al., 2011 ; Gao et al., 2017).
La biosynthèse de ces molécules par des microorganismes tels que Saccharothrix algeriensis est une ressource intéressante à exploiter et qui pourrait constituer une alternative à leur synthèse organique complexe, onéreuse et polluante. Parmi les stratégies citées dans la littérature sur l’optimisation de la production des métabolites secondaires par les microorganismes, la modification de la composition chimique des milieux de cultures des microorganismes et l’utilisation des éliciteurs constituent des moyens efficaces, simples et peu onéreux. Nous nous intéressons dans le cadre de cette revue bibliographique aux moyens d’élicitation des métabolites secondaires des Actinobactéries et plus particulièrement à l’élicitation chimique.
Élicitation des métabolites secondaires
Il existe plusieurs moyens d’élicitation des métabolites secondaires produits par les microorganismes parmi lesquels l’élicitation biologique, l’élicitation moléculaire et l’élicitation chimique (Abdelmohsen et al., 2015 ; Rutledge et al., 2015 ; Müller & Wink, 2014 ; Wang et al., 2008). L’élicitation biologique fait appel à la co-culture entre microorganismes (bactérie-bactérie, champignon-bactérie ou champignon-champignon) ainsi qu’à l’addition de lysats bactériens dans des différentes cultures de microorganismes (Tableau 1.9).
Le stress oxydatif chez les bactéries
Le stress peut-être défini comme l’ensemble des conditions qui induisent des changements physiologiques chez les organismes vivants affectant ainsi leur croissance et générant des dommages cellulaires. Dans ces conditions hostiles le fonctionnement optimal des organismes est altéré. En conséquence, les organismes s’adaptent au stress en développant des mécanismes divers de résistance qui ont pour but une acclimatation dans ces nouvelles conditions de vie (Mittler, 2017 ; Booth, 2002).
Il existe deux types de stress environnementaux : biotique et abiotique. Le stress biotique est une forme de concurrence entre les organismes vivants telle que la prédation. Le stress abiotique est un changement physico-chimique des facteurs environnementaux tels que la salinité, la température, les rayons UV, l’oxygène, le pH, la présence de métaux, etc. Chez les bactéries, les réponses aux différents types de stress peuvent-être classifiées en deux catégories : une réponse générale et une réponse spécifique.
La réponse générale au stress est indépendante de la nature du stress et joue un rôle essentiel dans la survie des bactéries dans l’environnement. Elle peut se traduire par la conservation de l’intégrité de l’enveloppe cellulaire, la biogenèse de transporteurs contrôlés par des facteurs cytoplasmiques ou extra-cytoplasmiques ou la modification de la morphologie bactérienne (sporulation, formation de biofilm, acquisition de structures de motilité) (Lushchak, 2011).
La réponse spécifique au stress dépend de la nature du stress. Le stress oxydatif médié par les espèces réactives d’oxygènes (ROS) constitue un exemple de stress qui génère des réponses spécifiques chez les bactéries aérobies. Ces dernières possèdent des systèmes tels que la thiorédoxine, la catalase et d’autres enzymes anti-oxydantes qui permettent de neutraliser les ROS et minimiser leurs dommages cellulaires (Mittler, 2017 ; D’Autréaux et al., 2007).
Les principaux ROS générés par l’oxygène chez les bactéries sont l’anion superoxyde (O2.-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le radical hydroxyle (HO.). Ces espèces réactives d’oxygène attaquent tous les constituants cellulaires tels que les lipides, les protéines et les acides nucléiques et provoquent la mort cellulaire (Figure 1.11) (Møller & Sweetlove, 2010).
Figure 1.11: Les origines et les cibles des espèces réactives d’oxygène (extrait de l’article D’Autréaux et al., 2007). Les expéces réactives d’oxygène sont le radical hydroxyle, le peroxyde d’hydrogène et l’anion superoxyde. Ils ont des cibles différentes : le radical hydroxyle attaque les lipides, les acides nucléique et les acides aminés ; le peroxyde d’hydrogène oxyde les métalloenzymes et les résidus cystéines et méthionines et libère le fer des clusters fer-soufre Fe-S ; l’anion superoxyde forme des radicaux toxiques tels que le monoxyde d’azote. L’ensemble de ces modifications physiologiques engendrent des réponses de SOS chez les bactéries. La réponse SOS est un mécanisme de régulation qui permet l’adaptation et l’évolution de la bactérie quand les conditions environnementales l’exigent.
L’anion superoxyde (O2.-) est produit par des processus enzymatiques impliquant des enzymes, telles que NADPH oxydases ou des oxygénases cytochrome P450 dépendantes (Babior, 2001), ou des processus non enzymatiques médiés par des coenzymes, des flavines ou des groupements Fe-S (Babior, 2000).
Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) peut être formé au cours des différentes réactions comme, par exemple, pendant la réaction de dismutation spontanée du superoxyde ou lors de l’oxydation des protéines à fer, des flavoprotéines et d’autres composés cellulaires réduits (Touati, 2000). De plus, l’auto-oxydation, causée par des rayons UV, des thiols, des catéchols, des flavines, des déshydrogénases, des oxydases et des cytochromes engendre la formation du peroxyde d’hydrogène ainsi que de l’anion superoxyde.
Les radicaux hydroxyles peuvent êtres produits par la réaction de Fenton entre le peroxyde d’hydrogène et des ions ferreux ou d’autres métaux de transition (D’Autréaux et al., 2007).
Les mécanismes de défenses contre le stress oxydatif
Les mécanismes de défense des bactéries contre les ROS se traduisent par l’élimination des espèces réactives et le déclenchement des mécanismes généraux de réponse aux stress.
L’élimination des espèces réactives est assurée par des enzymes telles que la superoxyde dismutase (SOD), les catalases (CAT) et les peroxydases. La SOD élimine le radical superoxyde en le transformant en peroxyde d’hydrogène. Le peroxyde d’hydrogène sera ensuite dismuté sous l’action de la catalase en eau et en oxygène. Les catalases assurent la dismutation du peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène. Les peroxydases décomposent également le peroxyde d’hydrogène (D’Autréaux et al., 2007 ; Mishra & Imlay, 2012).
La protection des résidus cystéines des biomolécules contre l’oxydation est assurée par les thiol-transférases telles que la thiorédoxine et la glutathion réductase qui assurent la réduction des ponts disulfures.
La thiorédoxine est une protéine qui permet le transfert d’atomes hydrogènes vers les résidus cystéines grâce à un système thiorédoxine qui implique deux enzymes : la thiorédoxine peroxydase et la thiorédoxine réductase. Le transfert d’électrons du NADPH grâce à l’action de la thiorédoxine réductase permet la ré-oxydation de la thiorédoxine et la réparation des dommages aux protéines (Arnér & Holmgren, 2000).
Récepteurs des espèces réactives de l’oxygène chez les bactéries
Les bactéries possèdent des récepteurs spécifiques aux espèces réactives de l’oxygène parmi lesquels les facteurs transcriptionnels SoxR, OxyR et PerR.
SoxR est un facteur transcriptionnel spécifique des ions superoxydes (O2.-). L’oxydation du cluster SoxR [2Fe-2S]+ par l’anion superoxyde induit un changement conformationnel de SoxR ce qui affecte la liaison de ce dernier à l’opérateur de l’ADN et active la transcription du gène (Figure 1.12.a). La réduction SoxR est assurée par la ferredoxine-NADPH dépendante.
OxyR et PerR sont des facteurs transcriptionnels spécifiques du peroxyde d’hydrogène (H2O2) et des peroxydes organiques. OxyR et PerR sont des orthologues fonctionnels qui régulent des gènes communs responsables de la production des catalases, de la peroxyrédoxine et d’un régulateur transcriptionnel du métabolisme du fer. En outre, OxyR joue un rôle dans le contrôle de la thiorédoxine (Trx), de la glutathion réductase et de la glutarédoxine (Grx).
PerR agit comme un répresseur alors que OxyR comme un activateur.
L’oxydation d’OxyR par le peroxyde d’hydrogène permet sa fixation à l’ADN et l’activation de la transcription des gènes cibles. La réduction de ce facteur est assurée par la glutarédoxine (Grx) (Figure 1.12.b).
La PerR est aussi sensible au peroxyde d’hydrogène, qui oxyde le cluster [4Fe–4S]2+ de son centre actif en [3Fe–4S]+. Ce dernier étant instable, l’ion Fe2+ est libéré. Sous sa forme oxydée, le PerR se détache de l’opérateur, ce qui permet le déclenchement de la transcription (Figure 1.12.c).
Dans l’état de connaissance actuel, les chercheurs considèrent ce facteur comme un répresseur qui une fois oxydée, perd sa fonction, le mécanisme de ré-oxydation mis en jeu est inconnu.
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Table des matières
Contexte et problématique
Objectifs et stratégies de la thèse
Organisation du manuscrit
Chapitre 1 : Revue Bibliographique
1.1. Le genre Saccharothrix
1.1.1. Saccharothrix algeriensis
1.1.1.1. Position taxonomique et caractéristiques
1.1.1.2. Activités biologiques de Saccharothrix algeriensis NRRL B-24137
1.2. Les Dithiolopyrrolones
1.2.1. Définition et propriétés structurales
1.2.2. Propriétés physico-chimiques des dithiolopyrrolones diversement substituées
1.2.3. Source de production des dithiolopyrrolones
1.2.3.1. Synthèse chimique
1.2.3.2. Source Biologique
1.2.4. Mécanisme d’action des dithiolopyrrolones
1.2.5. Intérêt des dithiolopyrrolones
1.2.5.1. Utilisation dans l’agriculture
1.2.5.2. Utilisation dans le domaine médical
1.3. Élicitation des métabolites secondaires
1.3.1. Notion d’éliciteur chimique
1.3.2. Élicitation chimique
1.3.2.1. Le stress oxydatif chez les bactéries
1.3.2.1.1. Les mécanismes de défenses contre le stress oxydatif
1.3.2.1.2. Récepteurs des espèces réactives de l’oxygène chez les bactéries
1.3.3. Élicitation chimique par des inducteurs du Quorum Sensing
1.3.3.1. Communication bactérienne : le Quorum Sensing
1.3.3.2. Historique
1.3.3.3. Auto-inducteurs du Quorum Sensing
1.3.3.4. Les différentes molécules inductrices du QS
1.3.3.5. Quorum Sensing chez les Actinobactéries
1.3.4. Systèmes bio-électrochimiques
1.3.4.1. Mécanismes de transfert des électrons
1.3.4.2. Synthèse microbienne électro-assistée
1.3.4.2.1. Principe de la synthèse microbienne électro-assistée
1.3.4.2.2. Paramètres d’optimisation
1.4. Conclusion générale
Chapitre 2 : Matériel et Méthodes
2. Microorganisme
2.1. Milieux de cultures microbiennes
2.1.1. International Streptomyces Project 2 (ISP2)
2.1.2. Milieu semi-synthétique basal (SS)
2.2. Conservation de la souche
2.2.1. Production de spores
2.2.2. Récupération et stockage des spores
2.2.3. Comptage des spores
2.3. Conditions de culture
2.3.1. Pré-culture
2.3.2. Cultures
2.3.3. Préparation des réactifs
2.4. Méthodes analytiques
2.4.1. Dosage des dithiolopyrrolones par HPLC
2.4.2. Quantification de la biomasse par mesure du poids sec
2.5. Détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices et Bactéricides
2.6. Matériel électrochimique
2.6.1. Cellule électrochimique
2.6.2. Électrodes de travail et contre-électrode
2.6.3. Électrode de référence
2.7. Technique électrochimique
2.8. Microscopie à épifluorescence 3D
2.9. Analyses statistiques des données
Chapitre 3 : Étude de l’effet des éliciteurs chimiques sur la biosynthèse de dithiolopyrrolones par Saccharothrix algeriensis
3. Stratégie de travail
3.1. Effet de la gamma-butyrolactone (ɤ-butyrolactone, GBL)
3.1.1. Effet de la concentration en GBL
3.1.2. Effet du temps d’addition de la GBL
3.2. Effet des homo-sérines-lactones (HSL)
3.2.1. Effet de la N-butyryl-Homosérine lactone (C4-HSL)
3.2.1.1. Effet de la concentration en C4-HSL
3.2.1.2. Effet des ajouts successifs de la C4-HSL
3.2.2. Effet de la N-(3-oxo-dodécanoyl)-Homosérine lactone (3-oxo-C12-HSL)
3.2.2.1. Effet de la concentration en 3-oxo-C12-HSL
3.2.2.2. Effet des ajouts successifs de la 3-oxo-C12-HSL
3.2.2.3. Effet des ajouts simultanés et successifs de la C4-HSL et la 3-oxo-C12-HSL
3.2.3. Effet de la 3-OH-C12-HSL
3.2.3.1. Effet de la concentration en 3-OH-C12-HSL
3.3. Discussion
3.3.1. Effet de la Gamma-butyrolactone
3.3.2. Effets des Homosérines-lactones
3.4. Conclusion
3.5. Influence de solvants organiques sur la production de dithiolopyrrolones
3.5.1. Toxicité des solvants
3.6. Effet des alcools
3.6.1. Effet de l’éthanol
3.6.2. Effet du butan-1-ol
3.6.3. Effet de l’ajout des inhibiteurs des espèces réactives de l’oxygène (ROS)
3.6.3.1. Effet du diphénylène iodonium (DPI) et de l’azoture de sodium (NaN3)
3.7.3. Discussion
3.7.4. Conclusion
3.8. Effet du diméthylsulfoxyde (DMSO)
3.8.1. Effet de la concentration en DMSO
3.8.2. Effet du temps d’addition du DMSO
3.8.3. Effet des ajouts successifs du DMSO
3.8.4. Discussion
3.8.5. Conclusion
Chapitre 4 : Étude de l’effet d’une électrode polarisée sur la biosynthèse des dithiolopyrrolones par Saccharothrix algeriensis.
4. Introduction
4.1. Sélection de l’électrode de travail
4.2. Effet du potentiel d’électrode sur le comportement de Saccharothrix algeriensis
4.2.1. Effet des potentiels de + 0,2 et + 0,3 V/ECS
4.2.2. Effet du potentiel 0 V/ECS
4.2.3. Effet des potentiels de – 0,2 et – 0,3 V/ECS
4.2.4. Effet du potentiel de -0,3 V/ECS appliqué après 24 h de culture.
4.2.5. Quantification de la biomasse et des dithiolopyrrolones à différents potentiels
4.2.6. Études des charges échangées à – 0,3 V/ECS
4.3. Investigations sur l’effet du matériau de l’électrode de travail
4.3.1. Électrode en acier
4.3.2. Électrodes en carbone
4.3.3. Électrodes en platine
4.4. Discussion
4.4.1. Choix du matériau d’électrode
4.4.2. Études chronoampérométriques de l’effet du potentiel
4.4.3. Échanges des charges électriques à – 0,3 V/ECS et production de dithiolopyrrolones .
4.4.4. Effet du matériau de l’électrode de travail sur la production des dithiolopyrrolones
4.5. Conclusion
Conclusion générale et perspectives
Élicitation par des composés chimiques
Utilisation d’une électrode polarisée dans le milieu de culture
Références bibliographiques
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