Etude de l’effet de CDA F1 sur l’absorption des triglycérides

La Caféine à 20 mg/ Kg (Caféine pour analyse PROLABO®) a été prise comme référence pour ses effets lipolytiques et thermogéniques (SHIMODA H. et coll., 2006 ; CHEN T-Y., 2008 ; SUNG J-H. et coll., 2011) et l’Orlistat à 50 mg/ Kg (Xenical®, gélules 120 mg) pour ses effets sur l’hydrolyse des lipides au niveau de l’intestin (XIA D. et coll., 2010).

La Caféine et CDA F1 ont été dissouts dans de l’eau distillée et Orlistat dans une solution de NaCl à 0,9 % (SUNG Y-Y. ET COLL., 2011). Ils ont été administrés chez les animaux dans un volume de 300 µl. L’étude de l’activité amincissante de l’extrait CDA F1 a été effectuée sur des souris femelles de race Swiss, âgées de 4 semaines (GOYAL R. K. ET COLL., 2006) élevées à l’animalerie du Laboratoire de Pharmacologie Générale et de Pharmacocinétique.

Pour étudier l’effet amincissant de CDA F1, les tests ont été menés sur des animaux rendus expérimentalement obèses.

Pour induire l’obésité, les souris femelles âgées de 4 semaines ont été soumises à un régime hyperlipidique pendant 4 semaines. Ce régime est constitué de 5 g de provende mélangée avec 2 g de saindoux par souris par jour (YAO Y. et coll., 2010).

Au bout de 28 jours, seules les souris qui ont atteint un poids supérieur ou égal à 30 g ont été retenues pour les tests (GOYAL R. K. et coll., 2006).

Les souris rendues obèses ont été élevées dans des cages individuelles dans les mêmes conditions de température et de cycle 12h/ 12h lumière/ obscurité (SHIMODA H. et coll, 2006). Cinq grammes de provende normale et de l’eau à volonté ont été mis à la disposition de chaque animal par jour pendant les 28 jours de traitement par voie orale.

Les tests préliminaires ont montré que l’extrait CDA F1 commence à agir à la dose de 250 mg/ Kg. Ainsi, 2 doses : 250 mg/ Kg et 500 mg/ Kg ont été utilisées lors des études de l’activité amincissante de CDA F1.

Pour étudier la variation de poids des animaux traités avec CDA F1, des souris rendues obèses ont été utilisées et réparties au hasard en 4 lots de 5 animaux. Durant les 28 jours de traitement, la variation du poids a été suivie. Pour voir cette variation de poids, les souris ont été pesées tous les matins à jeun (GOYAL R. K. et coll., 2006), puis les différents produits ont été administrés par voie orale dans un volume de 300 µl, c’est-à-dire de l’eau distillée pour le lot témoin, de la caféine à 20 mg/ Kg (SHIMODA H. et coll., 2006) pour le lot de référence et CDA à 250 mg/ Kg et 500mg/ Kg pour les 2 derniers lots. Cinq grammes de provende et de l’eau à volonté ont été mis à la disposition de chaque souris après l’administration de ces différents produits.

Comme les tissus adipeux contribuent à la variation du poids, la variation de poids des tissus adipeux a été également étudiée. Pour cela, à la fin des 28 jours de traitement, les souris ont été sacrifiées, puis une laparotomie a été pratiquée et les tissus adipeux abdominaux, périrénaux, péricardiaques et scapulaires ont été prélevés et pesés (MURASE T. et coll., 2002), et les tissus adipeux des animaux traités avec les différents produits ont été comparés avec ceux des animaux du lot témoin.

La réduction de la prise de nourriture est un des moyens qui permettent de lutter contre l’obésité (BRAY G. A et GREENWAY F. L., 1999), comme les produits amincissants appelés anorexigènes qui diminuent l’appétit. Pour voir si CDA F1 possède anorexigène, la prise de nourriture des animaux traités avec cet extrait a été suivie. Les souris rendues obèses ont été réparties au hasard en 4 lots de 5 animaux.

Cette étude a duré 28 jours (RYANGHYOK I. et coll., 2008) et la prise de nourriture a été suivie pendant toute la durée du traitement. Chaque animal a reçu 5g de provende et de l’eau à volonté par jour. Tous les matins, les restes de provende de la veille ont été pesés, ensuite, les différents produits ont été administrés par voie orale dans un volume de 300µl, c’est-à-dire que le lot témoin a reçu de l’eau distillée, de la caféine à 20 mg/ Kg (SHIMODA H. et coll., 2006) pour le lot de référence et CDA F1 à 250 mg/ Kg et 500 mg/ Kg pour les 2 lots derniers lots.

La quantité de nourriture ingurgitée a été déterminée en calculant la différence entre le poids de la nourriture de la veille et celui de la nourriture qui reste le matin. Les résultats pour chaque lot sont exprimés en moyenne de la quantité de nourriture ingurgitée (MURASE T. et coll., 2002).

La dépense énergétique a été mesurée par calorimétrie indirecte, c’est-à-dire que la chaleur produite par les différents processus métaboliques a été calculée à partir des échanges gazeux, pour cette étude c’est la consommation en O2 qui a été mise en jeux (PERRIN D., 2003).

Les souris femelles rendues obèses ont été réparties au hasard en 4 lots de 5 animaux. Les mesures du métabolisme ont été effectuées dans un environnement calme et dans l’obscurité à une température maintenue à 24 ± 1 °C (DINULESCU D. M. et coll., 1998). La consommation en oxygène a été mesurée tous les jours à l’aide du Macrorespiromètre de Cassagne constitué par une cage transparente en plastique de 17 x 10 x 14 cm munie d’un manomètre contenant de l’eau colorée (Pierron Réf. 15213) (Figure1). L’animal a été enfermé individuellement et hermétiquement dans le macrorespiromètre en présence de KOH. Le déplacement de l’eau colorée a été mesuré 10 minutes après (FRUCHT S. S. et COLL, 2005 ; Mc LEAN J. A. et TOBIN J., 2007).

Ces mesures ont permis d’obtenir le volume d’oxygène consommé observé (VO2 Obs.). Après ces mesures, les différents produits ont été administrés par voie orale dans un volume de 300µL, c’est-à-dire de l’eau distillée pour le lot témoin, de la caféine à 20 mg/ Kg pour le lot de référence et CDA à 250 mg/ Kg et 500 mg/ Kg pour les 2 derniers lots. Cinq grammes de provende et de l’eau à volonté par jour ont été mis à la disposition de chaque souris.

Pour déterminer la dépense énergétique, la consommation en oxygène a été calculée sous les conditions standards de température et de pression : 25 °C et 760 mmHG de pression (RASTOGI S.C., 2005).

Le volume d’oxygène consommé corrigé (VO2 Corr.) a été calculé selon la formule : VO2 corr.=VO2obs.   XBar.Pr273°C X 760mmHGT°C+ 273°C

La dépense énergétique (DE) a été calculée à partir de la consommation en oxygène et de la surface corporelle de l’animal (RASTOGI S.C., 2005) selon la formule :

DE =VO2 corr. x coefficient thermique  Surface corporelle

Avec : DE : en Cal/ h VO2 corr. : en ml/ h

Coefficient thermique : 4,8 Cal/ ml

Surface corporelle : (3√(Poids)2/ 1000) m2

Le coefficient thermique est la quantité de chaleur produite par millilitre d’oxygène consommé. Il diffère pour chacun des trois macronutriments : les glucides, les protéines et les lipides, mais en moyenne, la valeur du coefficient thermique est de 4,8 KCal/ ml. (RASTOGI S.C., 2005)

La modification d’un processus métabolique des lipides constitue une autre approche en matière de produit anti-obésité (BRAY G. A et GREENWAY F. L., 1999). L’absorption des lipides apportés par la nourriture se fait au niveau du tractus gastro-intestinal et s’ils n’ont pas été absorbés, ils se retrouvent dans les excrétions des animaux (HAN L-K., 2001).
Ce test a duré 3jours et des souris non obèses ont été utilisées. Elles ont été réparties au hasard en 4 lots de 5 souris et ont été logées dans des cages dont le fond a été équipé d’un tamis en métal servant à récolter les fèces. Les différents produits ont été administrés par voie orale à raison de 300 µl par animal. Le lot témoin a reçu une solution de NaCl à 0,9% (SUNG Y-Y. ET COLL., 2011), de l’Orlistat à 50 mg/ Kg pour le lot de référence (XIA D. et coll., 2010) et CDA à 250 mg/ Kg et 500 mg/ Kg pour les 2 derniers lots. Chaque animal a ensuite reçu un régime riche en lipide composé de 5 g de granule de provende additionné de 2 g de saindoux par jour pendant les 3 jours.

Au bout de 3 jours, toutes les souris ont été mises à jeun pendant 14h. Ensuite, elles ont été exsanguinées, le sang a été recueilli dans des tubes non héparinés et la triglicéridémie et la cholestérolémie ont été tout de suite déterminées (XIA D. et coll., 2010) au sein du Laboratoire de formation et de recherche en biologie médicale (LBM) de la FACULTE DE MEDECINE D’ANTANANARIVO.

Pendant les dernières 24 heures du test sur la digestion des lipides, les fèces des souris ont été collectées. La quantité en graisse contenue dans celles-ci a été ensuite déterminée (HU J-N. et Coll., 2008). Les fèces collectées on été séchées et les lipides ont été par la suite extraits de ces fèces par la méthode de Bligh E. G. et Dyer W. J. (1959) (TAKAHIRO T. et coll., 2006; TAMURA M. et coll., 2011)

Trois-cent milligrammes de fèces séchées ont été broyées dans un tube à essai. Ensuite, 4mL de Méthanol, 2 ml de Chloroforme et 0.4 ml d’eau distillée ont été ajoutés dans le tube contenant les fèces broyées. Le mélange a été homogénéisé au vortex pendant 30 secondes, puis, 2 ml de Chloroforme et 2 ml d’eau distillée y ont été ajoutés et de nouveau homogénéisé au vortex pendant 30 secondes. Le tube à essai a été ensuite centrifugé à 1000 trs/ min pendant 15minutes à la température du laboratoire. La phase supérieure, contenant le Méthanol et l’eau, a été enlevée tandis que la phase inférieure, contenant le Chloroforme et les lipides, a été recueillie dans une boîte de Pétri préalablement tarée. Les restes de solides au fond du tube à essai ont subi une deuxième extraction avec 1 ml de Chloroforme, 1 ml de Méthanol et 2 ml d’eau distillée. Le mélange a été homogénéisé au vortex pendant 30 secondes puis centrifugé à 1000 trs/ min à nouveau pendant 15 minutes à la température du laboratoire. La phase supérieure, contenant le Méthanol et l’eau, a été enlevée. La phase inférieure, contenant le Chloroforme et les lipides, a été recueillie dans la boîte de Pétri pré-pesée contenant la première phase chloroformique. La boîte de Pétri a été ensuite placée dans une étuve afin d’évaporer le Chloroforme. Lorsque le Chloroforme a été complètement évaporé, la boîte de Pétri contenant les lipides a été de nouveau pesée (SHAHIDI F., 2001) ;

D’une manière générale, CDA F1 et Caféine font perdre du poids (figure 2). Après 28 jours d’observation, le poids des souris du lot témoin qui ont reçu de l’eau distillée ne varie pas, il passe de 30,6 ± 0,4 g à 31,2 ± 0,86 g. Le poids des animaux traités avec Caféine à 20 mg/ Kg diminuent au bout de 18 jours d’administration par voie orale. Il est passé de 30 ± 0 g à 29 ± 0,03 g soit une diminution de 6,66 ± 1,06%. Les animaux continuent à perdre du poids jusqu’à la fin des 28 jours de traitement (p<0.05).

Après 2 jours d’administration orale, le poids des animaux traités avec CDA F1 diminue en fonction de la dose administrée jusqu’à la fin du traitement. Leurs poids passent de 30,6 ± 0,4 g à 27,8 ± 1,46 g chez le lot traité avec CDA F1 à 250 mg/ Kg, soit une diminution de 9,30 ± 3,87 % et à la dose de 500 mg/ Kg, le poids des souris passe de 31,8 ± 0,49 g à 26,75 ± 0,76 g, soit une diminution de 16,38 ± 1,24% (Figure2).
A la fin des 28 jours d’expériences, en pesant les différents tissus adipeux prélevés, aucune différence n’est observée entre les poids des tissus adipeux des souris du lot traité avec CDA F1 à 250 mg/ Kg et ceux des souris du lot témoin (Figure3).
Chez les animaux du lot traité avec CDA F1 à 500 mg/ Kg, le poids des tissus adipeux abdominaux (0,54 ± 0.38 g) et scapulaires (0,09 ± 0.01 g) est inférieur à celui des souris du lot témoin où le tissu adipeux abdominal pèse 1,72 ± 0,26 g et le tissu adipeux scapulaire 0,19 ± 0,06 g. Le poids des tissus adipeux abdominaux (0,94 ± 0,11 g) et scapulaires (0,11 ± 0,01 g) des souris du lot traité avec la Caféine à 20 mg/ Kg sont également inférieurs à celui des souris du lot témoin (p<0,05).

Par contre, le poids des tissus adipeux péricardiques et périrénaux ne présente aucune différence entre les souris du lot témoin et celui des 3 lots traités avec CDA F1 à 250 mg/ Kg et à 500 mg/ Kg et la Caféine à 20 mg/ Kg, c’est-à-dire que CDA F1 diminue le poids de la masse graisseuse et l’effet est bien visible au niveau des graisses abdominales et scapulaires.

La prise de nourriture des animaux des différents lots ne présente aucune variation significative durant les 28 jours de traitement (figure 4). L’extrait CDA F1 n’agit pas sur la prise de nourriture, c’est-à-dire qu’il est dépourvu d’activité anorexigène.
Variation de la prise de nourriture des souris femelles obèses du lot témoin, des lots traitées avec CDA F1 à 250 mg/Kg et 500 mg/Kg et du lot traité avec la Caféine à 20mg/Kg (produit de référence) administrés par voie orale pendant 28 jours. (Moyenne ± e.s.m, n=5, *p<0.05).

A la fin des 28 jours de traitement, la dépense énergétique des souris du lot témoin ne présente aucune variation significative. Il en est de même pour les souris traitées avec CDA F1 à 250mg/ Kg (Figure 5).
Celle des souris traitées avec CDA F1 à 500 mg/ Kg augmente au 20è jour d’administration orale par rapport à J0 jusqu’au 28ème jour de traitement (p<0,05). Elle passe de 37,19 ± 5,29 Cal/ h/ m2 à 54,44 ± 3,75 Cal/ h/ m2 à la fin des 28 jours d’administration. Enfin, la dépense énergétique des souris du lot traité avec la caféine à 20 mg/ Kg augmente au 10ème (47,6 ± 4,52 Cal/ h/ m2) et au 20ème (54,06 ± 5,16 Cal/ h/ m2) (p<0,05). CDA F1 augmente la dépense énergétique.

A la fin des expériences, les résultats des analyses révèlent que la triglycéridémie des souris traitées avec CDA F1 à 250 mg/ Kg et à 500 mg/ Kg est inférieure à celle des souris du lot témoin (p<0,05). Ces triglycéridémies sont de 1,57 ± 0,05 mmol pour CDA F1 à 250 mg/ Kg et 1,25 ± 0,25 mmol pour CDA F1 à 50mg/ Kg tandis qu’elles sont de 1,45 ± 0,09mmol pour le lot traité avec Orlistat à 50 mg/ Kg, et 2,41 ± 0,33 mmol.

La cholestérolémie des souris des lots traités avec CDA F1 à 250 mg/ Kg et à 500mg/ Kg ainsi que celle des souris traitées avec Orlistat à 50 mg/ Kg sont respectivement de 6,9 ± 0,73 mmol, 6,25 ± 0,6 mmol et 6,36 ± 0,82 mmol ce qui ne présente pas de différence par rapport à celle des souris du lot témoin dont la valeur est de 6,5 ± 0,83 mmol (N.S) (Figure6).

Au bout de 3 jours d’administration par voie orale de CDA F1 et Orlistat, la quantité de lipide contenu dans les fèces des souris est élevée par rapport à celle des souris du lot témoin qui est de 4,5 ± 0,41 g/ 100 g (Figure 7). Elle est de 7,03 ± 0,60g/ 100 g pour le lot traité avec CDA F1 à 250 mg/ Kg, 9,12 ± 0,47g/ 100 g pour celui traité à la dose de 500 mg/ Kg (Figure 7). La quantité de lipide contenue dans les fèces des animaux du lot traité avec le produit de référence, Orlistat à 50 mg/ Kg est de 34.73 ± 1,92 g/ 100 g (p<0,05). Les résultats montrent que CDA F1 augmente l’élimination des lipides par les fèces.

Toxicité :

Après une administration orale de fortes doses de CDA F1, les animaux montrent des signes de toxicité tandis que les souris ayant reçu de l’eau distillée n’en présente aucun (Tableau III). Cinq minutes après l’administration orale de CDA F1 à 1 g/ Kg, 40% des souris présente une tachypnée pendant 37 min, et après cette période, le comportement des souris redevient normal.
Soixante pourcent des animaux traités avec une dose unique de CDA F1 à 3g/ Kg présentent également une tachypnée 5 min après l’administration et cet effet persiste pendant 43 min après l’administration orale du produit. A partir de la 14è minute, l’activité motrice de 30% des animaux diminue pendant les 120 min d’observation.

Après 3 min de l’administration orale de CDA F1 à 9 g/ Kg, 60% des souris présentent une tachypnée, l’effet persiste pendant 83 min. Une diminution de l’activité motrice se manifeste chez 40% des animaux pendant les 120 min d’observation. Une diarrhée commence à apparaitre chez 10% des souris de ce lot à partir de la 23ème minute suivant l’administration orale et finit par atteindre toutes les souris après 43 min de l’administration.
Tous les signes de toxicité disparaissent 24h après l’administration de CDA F1 chez toutes les souris et pendant les 7 jours d’observation quotidienne. Pendant la durée des observations, aucune mortalité n’est observée (Tableau III).