Détermination de la résistance aux antibiotiques des souches de Staphylocoques à Coagulase Négative isolées des échantillons sanguins de patients fébriles dans des centres de santé de la région Analamanga

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Matériels utilisés

Matériels biologiques

Des souches de SCN isolées à partir d’échantillons sanguins de patients fébriles ont été utilisées et analysées au cours de cette étude.

Matériels de laboratoire

– Consommables : gants, masques, Oses stériles / Anses de platine, pipettes de transferts stériles, bec Bunsen, bouteille à gaz

– Culture

o Milieux solides (gélose au sang) coulés dans des boites de Pétri

o Bec benzène

o Matériels utilisés pour l’identification des colonies

Milieux de culture : gélose au sang coulée dans des boites de Pétri en plastique et en verre

Etuve à 37°C

– Pour l’examen microscopique

Microscope optique (objectif x 100) Huile à immersion

Lames et lamelles Colorant de Gram

Produits antiseptiques

– Matériels utilisés pour l’identification biochimique

o Eau oxygénée (catalase)

o Galeries API STAPH (bioMérieux)

– Matériels utilisés pour l’identification moléculaire

o Kit d’extraction d’ADN o Mix d’amplification

o Kit GenoType Staphylococcus (Hain Lifescience)

Type d’étude et considération éthique

Il s’agit d’une étude prospective descriptive effectuée dans le cadre de la surveillance des maladies infectieuses effectuée après accord du Comité d’Ethique du Ministère de la Santé Publique de Madagascar et respectant la confidentialité et l’accord signé des patients et des parents pour les enfants.

Population d’étude et collecte des échantillons biologiques

Les souches de Staphylocoques étudiées ont été isolées des hémocultures des patients fébriles hospitalisés ou venus en consultation dans les Centres de Santé de Base d’Isotry et d’Imerintsiatosika, dans les Centres Hospitaliers Universitaires de Fenoarivo et de Tsaralalàna (CHUMET). Les études font partie du Programme de Surveillance de la Fièvre Typhoide en Afrique Subsaharienne (TSAP) financé par la Fondation Melinda et Bill Gates à travers la Coopération de l’Université d’Antananarivo et International Vaccine Institute de Séoul. Les souches ont été collectées à partir des hémocultures ayant poussé en moins de 3 jours.

Notons que les patients fébriles infectés par Staphylocoques ont été inclus dans l’étude tandis que les patients fébriles non infectés ont été exclus.

Activités de laboratoire

Echantillonnage et conservation des souches à tester

Nous avons analysé 166 souches de Cocci Gram Positif ayant été identifiées par l’automate BACTEC. Par la suite, notre étude a porté sur 53 souches de SCN isolées et identifiées selon les méthodes de bactériologie standards puis par les méthodes biochimique et moléculaire.

Avant et après la réalisation de chaque test, les souches ont été conservées à moins 20 °C dans des cryotubes à billes.

Contrôle de qualité

Des souches de Staphylococcus fournies par ATCC ont été utilisées, et ont été conservées à moins 20°C pour d’éventuelles utilisations.

Identification des espèces de SCN

Identification bactériologique

– Préparation des milieux

Les milieux utilisés ont été des géloses au sang de mouton, conservés à +4°C en attendant leur utilisation.

– Isolement et identification des souches de Staphylocoques

Dans un premier temps, l’isolement et la première identification des souches de Staphylocoques ont été obtenus par la culture sur gélose au sang incubée à 37°C pendant 24 à 48 heures, suivie d’une coloration de Gram des colonies obtenues.

o Principe : l’isolement des staphylocoques a été réalisé à partir des colonies avec détermination des caractéristiques suivantes :

Caractéristiques macroscopiques : il s’agit de l’aspect morphologique des colonies (consistance, couleur, relief)

Caractéristiques microscopiques : il s’agit de l’aspect morphologique à l’examen direct au microscope à l’objectif x100, après coloration de Gram.

o Technique

 L’ensemencement a été effectué en stries, les souches ayant été conservées dans des cryotubes à billes sur les milieux de culture type gélose au sang coulés dans des boites de Pétri en verre.

Puis, l’incubation a été réalisée dans l’étuve à 37°C pendant 24 heures.

o Résultats attendus : le développement de colonies blanches, crémeuses est visible en 24 heures et des Cocci Gram Positif en grappe seront mis en évidence à l’examen microscopique à l’objectif x100 avec de l’huile à immersion.

(1) Ensemencement en stries(2) Développement de colonies blanches sur gélose au sang

(3) Etalement sur lame d’une suspension de bactéries

(4) Aspect microscopique des Cocci

Gram Positif en grappe

Figure 3 : Procédure d’identification morphologique des bactéries

Les principales étapes (1) à (4) de l’identification des SCN par les techniques d’identification standard sont représentées successivement sur cette figure 4, l’isolement par ensemencement sur gélose au sang permet la mise en évidence des Cocci Gram Positif souvent disposés en amas ou en grappe.

Identification biochimique

L’identification biochimique a été réalisée par l’utilisation de l’API STAPH (Kit d’identification fourni par Biomérieux).

– Principe

o Il s’agit d’un test biochimique miniaturisé comportant 20 microtubes et qui utilisent des tests d’acidification ou d’assimilation des sucres et des tests enzymatiques.

o Ces galeries consistent essentiellement à l’identification des espèces de staphylocoques à coagulase négative.

o Toutes les étapes ont respecté les instructions du manuel fourni avec le kit.

– Technique

o En premier lieu, nous avons procédé à l’inoculation d’une suspension bactérienne (obtenue à partir des souches isolées de la culture) dans les microtubes de la galerie

o Puis les souches ont été incubées à 37°C dans l’étuve pendant 18 à 24 heures.

o La lecture de la galerie a été effectuée après incubation suivant un tableau de lecture (fourni avec le kit).

– Résultat et interprétation

o Les résultats ont été déterminés selon l’aspect des virages colorés (Figure 5)

une couleur rose franche ou violette ou rouge indique une réaction positive

une couleur rose pâle ou rose claire indique une réaction négative

o L’identification a été réalisée à partir du profil numérique, après addition des valeurs correspondantes aux réactions positives.

o Ensuite, la confirmation des résultats a été réalisée par un logiciel Apiweb (nécessitant une connexion à l’internet) qui a permis de déterminer les espèces identifiées selon un pourcentage d’identification qui correspond à la probabilité d’identification de l’espèce. Le seuil du pourcentage d’identification a été de 75%.

Mise en suspension de colonies bactériennes

Humidification de la languette avec de l’eau distillée stérile

Mise en place de la galerie Inoculation de la suspension bactérienne dans les microtubes de la galerie

Réalisation du profil numérique après addition des valeurs correspondant aux réactions positives

Résultat négatif

Résultat positif

Figure 4: Représentation schématique de la procédure et des résultats de l’API STAPH

(La procédure complète peut être consultée en Annexe)

Etude moléculaire utilisant la technique PCR (Kit Genotype Staph, Hain, Lifescience, Allemagne, Biocentric France, www.biocentric.com)

– Principe

o Le test est basé sur la technologie DNA STRIP qui permet l’identification des souches staphylocoques S. aureus, S. haemolyticus, S.epidermidis, S. hominis, S. warneri, S. simulans et S. lugdunensis

o Il permet de détecter parallèlement le gène de résistance à la méthicilline mecA, ainsi que les gènes lukS-PV et lukF-PV codant la PVL (leucocidine de Panton et Valentine).

– Procédure

o Le test comporte trois phases dont :

L’extraction de l’ADN (i) à partir des cultures (bactéries fraîchement cultivées en milieu solide). L’amplification (ii) multiplex à l’aide d’amorces biotinylées (ADN polymérase thermostable) constitue la deuxième étape.

Ensuite, l’hybridation inverse (iii) nécessitant l’utilisation de réactifs et de bandelettes constitue la dernière étape comportant les manipulations suivantes : la dénaturation chimique de l’ADN amplifié, l’hybridation des amplicons simples brins biotinylés aux sondes pré-immobilisées sur la membrane, le lavage stringent, l’addition d’un conjugué streptavidine/phosphatase alcaline et la révélation chromogénique.

o Un contrôle de qualité est indispensable au bon déroulement du test et au bon fonctionnement des composants du kit.

o Chaque bandelette comporte 2 zones de contrôle avec une zone de Contrôle Conjugué pour contrôler la fixation du conjugué sur la bandelette et le bon déroulement de la révélation chromogénique et une zone de Contrôle Universel (UC) qui détecte les espèces bactériennes.

(i) Extraction de l’ADN

– Des bactéries fraîchement cultivées ont été utilisées comme matériel de départ pour l’extraction d’ADN.

– L’espace de travail a été exempt de toute trace d’ADN contaminant.

Le protocole suivant a été appliqué:

o Prélèvement avec une oese stérile de 5 colonies qui ont été mise en suspension dans 150 l d’eau stérile

o Incubation de la solution à 95°C pendant 10 minutes

o Centrifugation à vitesse maximale pendant 5 minutes, puis transfert du surnageant dans un microtube.

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Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I : Synthèse bibliographique sur les Staphylocoques à Coagulase Négative
I. Définition
II. Historique
III. Epidémiologie
III.1 Répartition géographique
III.2 Réservoirs ou habitats
III.3. Caractéristiques bactériologiques
III.3.1.Classification et taxonomie
III.3.2. Caractéristiques morphologiques et structurales
III.3.3. Caractères biochimiques
III.3.4. Caractères génétiques
IV. Physiopathogénie des infections à SCN
IV.1. Modes de transmission
IV.2. Facteurs de virulence
IV.2.1. Composants de la paroi
IV.2.2. Structures antigéniques
IV.2.3. Production de toxines
IV.2.4. Production d’enzymes
IV.2.5. Organisation en biofilm et production de «slime»
IV.2.5.1. Etapes de la formation du biofilm
IV.2.5.2.Facteurs impliqués dans la formation de biofilm
IV.2.6. Persistance dans les cellules hôtes
IV.2.7. Régulation des processus pathogènes
IV.2.8. Acquisition des gènes de résistance aux antibiotiques
V. Manifestations cliniques
V.1.Chez l’homme
V.1.1. Les infections dues aux espèces du groupe des S.epidermidis
V.1.2. Infections dues à l’espèce S. lugdunensis
V.1.3. Infections dues aux S. saprophyticus subsp. saprophyticus
V.2. Chez les animaux
VI. Diagnostic biologique
VI.1. Examens bactériologiques
VI.1.1. Prélèvement
VI.1.2. Culture
VI.1.2.1. Principaux milieux d’isolement
VI.1.2.2. Examen macroscopique
VI.1.2.3. Examen microscopique
VI.2.Tests biochimiques
VI.2.1. Test à la catalase
VI.2.2. Autres tests
VI.3. Examens sérologiques
VI.4. Diagnostic moléculaire
VI.4.1. Méthodes basées sur l’amplification
VI.4.2. Hybridation d’acide nucléique
VI.4.3. Identification par des méthodes spectroscopiques et spectrométriques
VI.5. Antibiogramme ou tests de sensibilité aux antibiotiques
VI.5.1. Définition
VI.5.2. Principe
VI.5.3. Procédure
VI.5.3.1.Contrôle de qualité
VI.5.3.2.Méthodes
VI.5.4. Facteurs influençant l’activité in vitro des antibiotiques
VI.5.4.1 Densité de l’inoculum
VI.5.4.2. Nature du milieu
VI.5.4.3. Durée d’incubation
VI.5.5. Résultats attendus ou interprétation de résultats
VI.5.5.1. Sensibilité aux antibiotiques
VI.5.5.2. Résistance aux antibiotiques
VII. Traitement
VII.1.Eléments importants à prendre en compte
VII.2. Molécules utilisées
VII.2.1. Bêta lactamines
VII.2.2. Macrolides
VII.2.3. Autres antibiotiques:
VII.3.Indications
VII.3.1. Selon la sensibilité aux antibiotiques
VII.3.2. Combinaisons thérapeutiques
VII.3.3. Selon les types d’infection
VII.4. Posologie et voie d’administration
VIII.Prophylaxie ou Prévention
CHAPITRE II : Identifications biochimique et moléculaire des souches de Staphylocoques à Coagulase Négative isolées des échantillons sanguins de patients fébriles dans des centres de santé de la région Analamanga
I. Intérêt de l’étude
II. Matériels et Méthodes
II.1. Cadre d’étude / Unités d’accueil
II.2. Matériels utilisés
II.2.1. Matériels biologiques
II.2.2. Matériels de laboratoire
II.3. Type d’étude et considération éthique
II.4. Population d’étude et collecte des échantillons biologiques
II.5. Activités de laboratoire
II.5.1. Echantillonnage et conservation des souches à tester
II.5.2. Contrôle de qualité
II.5.3. Identification des espèces de SCN
II.5.3.1. Identification bactériologique
II.5.3.2. Identification biochimique
II.5.3.3.. Etude moléculaire utilisant la technique PCR
II.6. Analyses statistiques
II.7. Retranscription des résultats dans des cahiers d’enregistrement
II.8. Limites de l’étude
III. Résultat
III.1. Caractéristiques de la population d’étude
III.1.1. Paramètres cliniques des patients
III.1.2. Signes cliniques présentés par les patients
III.1.3. Provenance des souches étudiées
III.2. Résultats de l’identification
III.2.1. Résultat global
III.2.2. Résultats de l’identification biochimique
III.2.3. Résultats de l’identification moléculaire
III.2.4. Résultats des deux techniques d’identification
III.2.4.1 Résultats des deux techniques d’identification selon les principales espèces identifiées
III.2.4.2. Résultats des deux techniques d’identification selon les principaux paramètres cliniques des patients et les tests d’identification
III.2.5. Résultats des analyses statistiques
IV. Discussion
CHAPITRE III : Détermination de la résistance aux antibiotiques des souches de Staphylocoques à Coagulase Négative isolées des échantillons sanguins de patients fébriles dans des centres de santé de la région Analamanga
I. Contexte et intérêt de l’étude
II. Matériels et méthodes
II.1. Cadre et période d’étude
II.2. Matériels utilisés
II.2.1. Matériels biologiques
II.2.2. Matériels de laboratoire
II.3. Population d’étude et collecte des échantillons biologiques
II.4. Activités de laboratoire
II.4.1. Echantillonnage et conservation des souches à tester
II.4.2. Test de sensibilité aux antibiotiques par la méthode de diffusion en milieu gélosé
II.4.3. Test de sensibilité aux antibiotiques sur galerie ATB STAPH
II.5. Analyses statistiques
III. Résultats
III.1. Résultat global
III.1.1. Résultats du test de sensibilité aux antibiotiques par ATB STAPH
III.1.2. Résultats du test de sensibilité aux antibiotiques par la méthode de diffusion en milieu gélosé
III.2. Résultats du test de sensibilité par ATB STAPH des principaux antistaphylococciques
III.3. Résultat du test de sensibilité aux antibiotiques par ATB STAPH selon les classes d’antibiotique
III.4. Résultats du test de sensibilité par ATB STAPH à la céfoxitine et à la vancomycine
III.5 Résultats de l’identification moléculaire et du test de sensibilité aux antibiotiques
III.6. Résultats de l’analyse statistique
III.6.1. Association entre la prise récente d’antibiotiques, la présence de mecA et la résistance à la céfoxitine
III.6.2. Résultats de la détermination de la résistance aux principaux antibiotiques de la classe des bêta-lactamines à partir des deux tests de sensibilité
IV. Discussion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES