Détection et quantification des sites d’attaque des radicaux hydroxyle sur les protéines

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La Modélisation Moléculaire

Devant parfois de grandes difficultés ou devant l’impossibilité d’étudier certains complexes, trop volumineux, présentant des interactions faibles ou transitoires, ou encore de natures hydrophobes comme les complexes membranaires, une alternative plus rapide aux méthodes expérimentales est la modélisation moléculaire ou « docking ». Ce processus consiste à modéliser une structure tridimensionnelle d’un complexe, et plus généralement son interface, à partir des structures connues de ses c onstituants. Cette modélisation peut se faire ab initio, c’est à dire sans données complémentaires, mais actuellement, les méthodes qui donnent les meilleurs résultats sont celles qui utilisent des données expérimentales biochimiques et/ou biophysiques sur la zone d’interaction [190]. Le niveau et la qualité des détails obtenus, dépendant du type de techniques expérimentales, vont peser sur la capacité des méthodes de modélisation à obtenir une bonne résolution du complexe étudié. L’utilisation de données de conservation de structure entre les espèces peut aussi servir pour caractériser les résidus des zones d’interactions.
Une expérience de modélisation moléculaire nécessitdeux étapes : les méthodes de « sampling » permettent de générer des structures ud complexe ; les méthodes de « scoring » identifient parmi les structures celles qui sont en bon accord avec les filtres utilisés. Les structures en faible accord sont écartées. Durantal modélisation moléculaire, divers degrés de flexibilité peuvent être introduits augmentant la ualitéq des structures obtenues mais aussi le temps de calcul. Ainsi, lors de la modélisation, des méthodes peuvent maintenir les structures des protéines du complexe rigides, autoriser certains chevauchements, ou introduire de la flexibilité dans les chaînes principales et/ou latérales des protéines. Les données expérimentales peuvent être introduites dès l’étapede « sampling », ou lors de l’étape de « scoring » pour améliorer le tri des solutions corectes en comparaison avec la modélisation ab initio [190]. L’incorporation des données expérimentales dès la première étape de modélisation permet pour sa part de réduire l’espac de recherche et ainsi d’enrichir le nombre de configurations correctes ou proches de l’être. L’utilisation de données expérimentales dans les deux étapes permet de réduire le champ d’investigation et donc de gagner du temps. En moyenne, le nombre de configurations possibles entre deux protéines peut atteindre 107. Ce chiffre augmente proportionnellement avec la taille du complexe et quand de la flexibilité est permise [191].
Il existe différents programmes de modélisation moléculaire (HADDOCK, RosettaDock, ICM-DISCO,…) plus ou moins performants selon les ty pes de complexes analysés [190-193]. Aucune de ces méthodes ne permet actuellement de donner les bonnes structures pour l’ensemble des complexes existants. Pour évaluer leur performance, un concours de prédiction à l’aveugle CAPRI (Critical Assessment of PRedicted Interactions) permet aux concurrents en quelques semaines de tester leurs méthodes sur de récentes structures de complexes de hautes résolutions non publiées [194]. Les structures obtenues sont maintenant, quand les conditions sont réunies, d’une précision de niveau atomique [193].
Devant l’impossibilité actuelle d’obtenir des structures de complexes de haute résolution pour toutes les protéines avec les méthodes de RMNet de cristallographie de rayons X, la caractérisation des interfaces protéine–protéine par des méthodes de plus basse résolution couplées ensuite avec des étapes de modélisation moléculaire est une approche incontournable. Toutefois, toutes ces méthodes présentent des limitations. L’ensemble des avantages et inconvénients est résumé dans leErreur ! Source du renvoi introuvable.. La plupart des méthodes, « cross-linking », oxydation des protéines, mutagenèse dirigée, « site directed labelling », incorporent des modifications sur les protéines pour pouvoir analyser les interactions. Ces modifications de structure peuvent entraîner des changements de conformations et ainsi fausser les résultats. La méthode d’échange 1H/2H est intéressante car l’incorporation d’un deutérium sur les liaisons amides n’entraîne pas de modification de la structure chimique de la protéine. Par contre, cette technique ne donne des informations que sur la chaîne principale de la protéine et l’incorporation en deutérium sur ces liaisons labiles ne facilite pas l’analyse par spectrométrie de masse.
La méthode que nous souhaitons développer s’appuie sur ce concept d’échange isotopique mais afin d’avoir une méthode de détection plus sensible nous avons choisi le tritium à la place du deutérium. De même, afin de ousn affranchir des problèmes de « back-exchange » rencontrés lors de l’échange sur les amides (N–H), nous avons choisi de réaliser cet échange sur des positions non labiles : des liaisons carbone–hydrogène (C–H). Enfin, afin d’avoir une couverture aussi complète que possible des zones d’interaction, toute la surface des protéines étudiées devra être le siège de cetchangeé 1H/3H et, en particulier, les chaînes latérales des acides aminés.

Détection et quantification des sites d’attaque des radicaux hydroxyle sur les protéines

Notre méthode de caractérisation des interactions rotéinep–protéine est basée sur l’accessibilité des acides aminés des protéines vis-à-vis des molécules d’eau. Après une étape de radiolyse de l’eau, les radicaux hydroxyle, générés à proximité de ces acides aminés, réagissent avec ces derniers conduisant à la formation de radicaux par arrachement d’un hydrogène. Ces radicaux sont alors quantifiés grâce à un marqueur radioactif, le tritium. Le principe de notre approche est basé sur l’identification et la quantification de radicaux sur les protéines.

Notre méthode a donc le potentiel de caractériser esl interactions protéine–protéine, de réaliser de la cartographie de surface, mais également de servir à éclaircir la formation, la localisation, la délocalisation et la propagation des radicaux sur les protéines. Ces phénomènes radicalaires peuvent se produirent de manière normale dans la cellule, dans des mécanismes enzymatiques, mais aussi lors d’événements tels le stress oxydant [195-198]. Malgré l’importance d’identifier et de quantifier les sites de réactions des radicaux (notamment des radicaux hydroxyle) sur les protéines, peu de méthodes sont disponibles. Il existe des techniques indirectes qui suivent l’apparition de produits de réaction avec les radicaux, observables par spectroscopie d’absorption ou de fluorescence [199]. Cependant, la technique principale est la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) [200, 201]

La RPE est spécifique des radicaux et permet de localiser le radical sur un type de structure donnée. Toutefois, cette méthode ne peutà elle seule différencier si le radical est par exemple sur telle ou telle tyrosine d’une séquence protéique. De plus, si l’observation directe des radicaux formés sur les protéines par la technique RPE est possible, leur très faible concentration et leur instabilité rendent ces observations difficiles. Toutefois, ces radicaux peuvent être détectés indirectement par RPE en convertissant ces radicaux primaires en des radicaux à plus longue durée de vie, en créant des adduits avec des molécules paramagnétiques radicalaires plus stables, les « spin trap ». Cependant, cette méthode de « spin-trapping » peut fournir des résultats erronés en interprétant un adduit comme étant le site d’un radical primaire, alors que dans certains cas, ce même adduit peut être obtenu par exemple par oxydation du « spin trap » réagissant ensuite sur un acide aminé non radicalaire.

Ces problèmes chimiques couplés à la difficulté inhérente d’interprétation des spectres RPE, peuvent empêcher l’identification non ambiguë des sites radicalaires sur les protéines [202].

Afin de résoudre les limitations liées à la RPE, la spectrométrie de masse est aussi utilisée pour détecter des adduits non radicalaires obtenus à partir de « spin trap » diamagnétiques. La sensibilité de la détection estdès lors améliorée en passant du nanomolaire pour la RPE au picomolaire, voire moins, pour la spectrométrie de masse. Toutefois, les problèmes chimiques liés aux « spintrap » sont toujours présents et la réactivité moyenne des radicaux sur ces « spin trap » (106-107 M-1.s-1) nécessite toujours l’utilisation de 100 à 1000 équivalents de « spin trap » [203]. Récemment, une molécule radicalaire stable, le TEMPO• , hautement réactive avec les radicaux carbo-centrés (5,107 à 2,10 9 M-1.s-1), a permis de créer un adduit stable non radicalaire détectabl par spectrométrie de masse. Cette méthode de « spin scavenging » présente le triple avantage,par rapport au « spin trapping », de pouvoir détecter plus de radicaux par un meilleur rendement d’adduit, d’être moins sensible aux réactions radicalaires secondaires et enfin d’êtrespécifique à l’étude de radicaux carbo-centrés [202].

Deux méthodes alternatives à la RPE sont basées surla détection des sites d’attaque des radicaux hydroxyle. La première utilise la réparation des radicaux carbo-centrés par des donneurs d’hydrogène en travaillant en milieu anaérobie. Ceci permet d’introduire un isotope stable (2H) sur les chaînes latérales des acides aminés, détectable par RMN du deutérium (RMN 2H) ou par spectrométrie de masse [204-206]. Toutefois, à ce jour, cette approche élégante n’a été appliquée qu’aux acides aminésauxet petits peptides, ce qui est en partie dû à la faible sensibilité apportée par le2H. La seconde est basée sur l’analyse par spectrométrie de masse des produits d’oxydations (hydroxylation, …) des radicaux de protéines générés en présence de radicaux hydroxyle et de dioxygène [178]. Ces phénomènes d’oxydation très courants sur les protéines en milieu aérobie sont galementé utilisés pour cartographier la surface des protéines [184].

Dans ce chapitre, nous décrivons une méthode alternative d’échange 1H/3H qui permet la détection des sites d’attaques des radicaux hydroxyle sur les protéines. Dans un premier temps, les origines de la méthode et les travaux préliminaires du laboratoire seront exposés. Puis, une échelle de réactivité de vingt acides aminés vis-à-vis des radicaux hydroxyle et de notre donneur d’atomes de tritium sera présentée. Enfin, notre méthode de détection de radicaux sera testée et validée sur de petits peptides.

Les origines de la méthode

Historique des méthodes de détection de radicaux par marquage au tritium

Ce paragraphe introductif traite de deux approches, datant des années 70, utilisant l’atome de tritium comme moyen de détection des radicaux sur les protéines. Ces méthodes permettent d’incorporer en surface, de manière stable sur des liaisons C–H, cet isotope de l’hydrogène. L’une d’entre elles est notamment utilisée pour cartographier les surfaces protéiques.

La première approche permet uniquement de détecterdes radicaux formés sur les acides aminés aromatiques des protéines (Tyr, Phe, His) etprincipalement sur le tryptophane (Trp) [207]. L’incorporation de tritium est obtenue en générant par photolyse des espèces radicalaires, formées suite à la rupture homolytique des liaisons C–H, N–H, O–H et S–H, qui •réagissent alors avec l’eau tritiée en arrachant untritium. Seuls les radicaux carbo-centrés (C) permettent d’incorporer de manière stable un 3H en formant une liaison C– 3H. Cette réaction, menée en milieu aérobie ou anaérobie, présente cependant une meilleure incorporation de tritium en absence d’oxygène. En raison de la sélectivité de marquage sur les seules positions aromatiques, cette approche est peu efficace et n’a pas donné suite à de nouvelles expériences.

La seconde approche, développée par Shishkov et Baratova [208-210], consiste aussi à introduire sur une protéine un tritium comme marqueur radioactif. La protéine est rapidement congelée dans l’azote liquide à 77 K en la projetant par spray sur la surface du réacteur en verre. Le gaz tritium 3H2 est atomisé par catalyse thermique en contact avecun filament de tungstène chauffé à 2000 K. La protéine congelée est alors bombardée sous vide avec un faisceau d’atomes de 3H chauds, ce qui permet un mécanisme de substitution directe 1H/3H, passant transitoirement par un radical C• au niveau des chaînes latérales des acides aminés situés à la surface de la protéine (Figure II-1). Les auteurs indiquent que la réaction se produit dès le premier contact du 3H• avec les liaisons C–H de surface avec une pénétration maximale de 3 à 5 Å.

L’analyse par séquençage automatisé de la protéinepermet de séparer les acides aminés 4 -1 ) permet de un à un puis de les collecter. Le calcul de l’ activité spécifique (Bq.nmol déterminer les acides aminés les plus exposés. Ainsi, les acides aminés se trouvant à la surface de la protéine ont une activité spécifique plus élevée, donc une incorporation de tritium plus importante, que ceux se trouvant enfouis. Cette méthode a été appliquée à la caractérisation de surface de diverses protéines [211-214]. La non-sélectivité de la méthode permet de marquer l’ensemble des liaisons de type C–H situées en surface. Le spectre d’application de cette méthode est donc assez large car pratiquement toutes les molécules biologiques présentent des fonctions de type C–H. De plus, l’atome de tritium, de par sa petite taille, est une très bonne sonde de surface en permettant d’obtenir un bon niveau de discrimination structurale. Néanmoins, ces travaux présentent des contraintes.Cette méthode requiert un appareillage très lourd avec notamment l’utilisation d’ampoule de gaz tritium de plusieurs centaines de GBq et ainsi toute une installation de radioprotection appropriée. De plus, bien que l’intégrité chimique de la protéine soit préservée lors de l’échange 1H/3H, la congélation de la protéine peut provoquer potentiellement sa dénaturation.

Mises à part ces difficultés, cette approche montre le potentiel du tritium comme indicateur de radicaux de surface et comme marqueur de surface protéique. En effet, l’utilisation de l’isotope radioactif de l’hydrogène permet, sans introduire de modification physique ou chimique de la structure, une détectionsensible des résidus marqués en surface. Récemment, une approche conceptuellement intéressante a été utilisée pour la détection de radicaux sur des acides aminés et des petits peptides, à l’aide de deutérium.

Principe de notre méthode de détection et de quantification de radicaux

Principe

Le laboratoire a développé une méthode permettanta ldétection et la quantification des sites d’attaques des HO • 13 H. Le principe est représenté sur les acides aminés par échange H/ schématiquement en deux étapes dans Figure II-3. Des radicaux hydroxyle arrachent les hydrogènes des chaînes latérales des acides aminésitués en surface de la protéine. Un agent de réparation tritié échange ensuite son tritium avec le radical formé. Ainsi, la présence d’un tritium indique la formation transitoire d’un radical carbo-centré. 1H 3H HO••V-3H Agent de réparation tritié 1H 1H 1H.

Cette approche nécessite principalement deux étapes:

– la génération de radicaux hydroxyle

– la réparation par un donneur de tritium

Production des radicaux hydroxyle : HO•

Les radicaux hydroxyle sont des espèces radicalaires hautement réactives et non spécifiques, qui réagissent sur les protéines principalement en s’additionnant sur les composés aromatiques (environ k = 1010 M-1.s-1) ou en arrachant les hydrogènes des liaisons C–H des acides aminés pour former des radicaux carbo-centrés. Leur constante de vitesse de réaction avec les liaisons C–H est de l’ordre de 10 8 M-1.s-1 soit 10 à 100 fois moins que la vitesse de diffusion [215]. Ceci indique qu’en moyenne un arrachement d’un hydrogène intervient toutes les 10 à 100 collisions des HO • avec les hydrogènes des liaisons C–H [205]. Ainsi, les HO• très réactifs auraient tendance à réagir en surfacedes macromolécules et leurs diffusions dans la structure protéique seraient limitées [216]. Cesradicaux représentent ainsi un outil de choix pour les études d’accessibilité de surfaces des protéines et des interactions protéine–protéine, en permettant d’obtenir une résolution au niveau du résidu acide aminé.

Les radicaux hydroxyle peuvent être produits de plusieurs manières. Trois grandes sources sont indiquées ci-dessous.

La réaction de Fenton permet de générer des radicaux hydroxyle en réduisant le peroxyde d’hydrogène par l’intermédiaire d’un métal de transition, le fer. La présence d’un agent 2+ réducteur, l’ascorbate, permet de régénérer Feet d’alimenter le cycle (Équation 1) [181]. Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO- + HO•.

Les radicaux hydroxyle peuvent également être produits par photolyse de l’eau avec un rayonnement UV de longueur d’onde inférieure à 185 nm, ou par photolyse du peroxyde d’hydrogène avec un laser de longueur d’onde autour de 250 nm [182, 217, 218]. La rupture homolytique de la liaison O–O produit deux molécules de HO• (Équation 2). H2O2 h 2 HO•

Les rayonnements ionisants permettent aussi de produire des radicaux hydroxyle en fournissant l’énergie nécessaire pour rompre la liaison H–O des molécules d’eau. Ce phénomène connu sous le nom de radiolyse de l’eau produit très rapidement l’ensemble des espèces représentées dans l’Équation 3. H2O HO• , H• , e-aq, HO2• , H2O2, HO-, H3O+, H2.

Les rayonnements ionisants peuvent être des photonsde haute énergie (rayons X et rayons γ), ou des particules, comme les électrons (particules β), les noyaux d’hélium (particule α) et des neutrons rapides [180, 183, 184]. La radiolyse de l’eau a l’avantage de ne pas nécessiter l’introduction de réactifs chimiques(H2O2, Fe2+) dans le milieu et de supporter une grande variété de conditions expérimentales. Les deux espèces majoritairement produites sont les électrons aqueux et les radicaux hydroxyle. La production de HO• peut être favorisée au détriment des autres espèces en fonction des conditions utilisées (Chapitre IV.B.1.b).

Dans notre étude, les radicaux hydroxyle seront produits par radiolyse de l’eau soit par les électrons émis par un accélérateur linéaire NAC(LI : Accélérateur linéaire d’électrons pour la radiolyse) au Laboratoire de Radiolyse du CEA, soit par autoradiolyse de l’eau tritiée dans notre laboratoire.

· Autoradiolyse de l’eau tritiée

Nous avons choisi d’utiliser l’eau tritiée comme source de HO• pour des raisons de commodité et de disponibilité pour réaliser un certain nombre d’étapes de mise au point de notre méthode. En effet, notre laboratoire est entre autre très bien équipé en matériels permettant l’utilisation d’eau tritiée de l’ordre de centaines de GBq en toute sécurité.

Dans le cas de l’utilisation de l’autoradiolyse de l’eau tritiée, l’atome de tritium se désintègre naturellement avec une émission d’un rayonnement β- suffisamment énergétique (Équation 4) pour provoquer la coupure homolytique d’une liaison H–O (autoradiolyse) en fournissant entre autres les radicaux hydroxyle . 31H 32He + β- Emax = 0,017 MeV.

L’autoradiolyse de l’eau tritiée permet de générerun débit de dose de l’ordre de dizaines de Gray6 par heure.

· Accélérateur linéaire d’électrons : le LINAC

L’accélérateur linéaire d’électrons (LINAC) permetpour sa part de générer les doses de dizaines de Gray en une seule impulsion de 10 nanosecondes, avec des électrons accélérés qui possèdent des énergies pouvant atteindre 10 MeV. Lerayonnement pulsé résolu en temps est un excellent outil pour l’étude des cinétiques faisant intervenir des espèces radicalaires issues de la radiolyse, et notamment pour la mesure directe des constantes de vitesses.

Le débit de dose est l’énergie fournie à la matière par unité de temps exprimé en Gy.h pour l’eau tritiée.

Les agents de réparation donneurs de tritium

Le donneur de tritium doit répondre dans l’idéal à plusieurs critères. Ce composé doit être le plus petit possible pour simuler l’accessibilité aux solvants des acides aminés de la protéine. De plus, l’étude des protéines en milieuaqueux suppose de trouver un composé hydrosoluble possédant une liaison X-H non labile à pH physiologique et suffisamment réactive pour réparer les radicaux carbo-centrés. eL processus d’échange 1H/3H peut se décomposer en deux étapes mettant en jeux deux constantes de vitesse: l’arrachement d’un hydrogène par les radicaux hydroxyle suivi de la réparation par incorporation d’un tritium sur le radical carbo-centré formé (Figure II-4). Pour treê un bon réparateur, la force de la liaison X– 3H du donneur doit permettre l’arrachement rapide de 3H par des radicaux de type C• , avec une vitesse la plus proche possible de celle d’arrachement par les HO• d’un 1H sur une liaison C–H (autour de 10 8-109 M-1.s-1). De plus, le radical formé sur le vecteur résultant du transfert de tritium sur les résidus acides aminés, doit êtretrès peu réactif vis-à-vis de la protéine analysée, pour éviter de former des adduits. Enfin,la synthèse de ce composé tritié doit être simple et rapide.

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Table des matières

Introduction générale
I Détection et caractérisation des interactions protéine–protéine
I.A Identification à haut débit des interactions protéine–protéine
I.A.1 Méthodes d’affinité couplées à la spectrométrie de masse
I.A.2 Le double hybride
I.A.3 Les systèmes de complémentation par fragments de protéine
I.A.4 Autres méthodes à haut débit
I.B Caractérisation structurale des interactions protéine–protéine
I.B.1 Caractérisation de structures de complexes protéiques
I.B.2 Caractérisation d’interface protéique
I.B.3 La Modélisation Moléculaire
II Détection et quantification des sites d’attaque des radicaux hydroxyle sur les protéines
II.A Les origines de la méthode
II.A.1 Historique des méthodes de détection de radicaux par marquage au tritium
II.A.2 Echange 1H/2H en présence de HO• et d’un donneur de 2H
II.B Principe de notre méthode de détection et de quantification de radicaux
II.B.1 Principe
II.B.2 Production des radicaux hydroxyle : HO•
II.B.3 Les agents de réparation donneurs de tritium
II.C Les résultats préliminaires du laboratoire
II.D Amélioration et optimisation de la méthode
II.E Echelle relative de réactivité des acides aminés
II.E.1 Détermination de la dose nécessaire pour une incorporation de tritium satisfaisante
II.E.2 Etude de la réactivité des acides aminés
II.F Détection et quantification des radicaux sur des peptides
II.F.1 Essais de marquage sur des peptides
III Application à la caractérisation de l’interaction entre la protéine humaine hAsf11-156 et un fragment de l’histone H3
III.A Méthode de caractérisation des interactions protéine–protéine
III.B La protéine Asf1
III.B.1 Le nucléosome
III.B.2 Rôles de la protéine Asf1
III.B.3 L’histone H3
III.B.4 La structure du complexe Asf1–H3/H4
III.C Caractérisation des acides aminés de H3122-135 en interaction avec hAsf11-156
III.C.1 Mise au point des conditions expérimentales
III.C.2 Caractérisation des acides aminés de H3122-135 impliqués dans l’interaction avec hAsf11 156
III.D Premiers essais sur la protéine hAsf1
III.E Conclusions
Conclusion générale
IV Matériels et méthodes
IV.A Préparation des composés
IV.A.1 Matériels commerciaux
IV.A.2 Expression et Purification de la protéine hAsf11-156
IV.A.3 Préparation de l’apomyoglobine
IV.A.4 La préparation du donneur de 3H (3H-BPASS)
IV.B Production de radicaux hydroxyle
IV.B.1 Deux sources de HO•: le LINAC ou l’autoradiolyse de l’eau tritiée
IV.B.2 Calibration de la dose généré avec le LINAC : Dosage de Fricke
IV.B.3 Descriptif du canon à électron (LINAC)
IV.B.4 Schéma de la jaquette de protection
IV.B.5 Procédure d’irradiation d’échantillons tritiés avec le LINAC
IV.C Le séquenceur d’Edman
IV.C.1 Le Principe
IV.C.2 Descriptif du matériel
IV.D Le compteur de scintillation liquide
IV.E Purification des échantillons par HPLC
IV.F Scintillation liquide et mesure de la radioactivité par HPLC
IV.G Protocole d’identification des radicaux sur les acides aminés
IV.H Protocole général de mesure de l’activité spécifique des PTH-acides aminés
IV.I Protocole d’identification des radicaux sur les peptides
IV.I.1 Protocole utilisant l’autoradiolyse de l’eau tritiée comme source d’HO•
IV.I.2 Protocole utilisant le LINAC comme source d’HO•
IV.J Protocole d’identification des radicaux sur le peptide H3122-135 et sur Asf11-156
IV.J.1 Protocole de marquage du peptide H3122-135
IV.J.2 Protocole de marquage de la protéine hAsf11-156
Bibliographie
V Annexe
V.A Mise au point de l’analyse sur le séquenceur
V.B Mise au point des conditions des expériences menées sur les peptides avec le LINAC.
V.C Etude des peptides en mélange après autoradiolyse de l’eau tritiée
V.D Interaction H3122-135 avec hAsf11-156
V.D.1 Interaction hAsf11-156 avec H3122-135
V.E Dichroïsme circulaire de l’apomyoglobine après irradiation avec le LINAC