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Déroulement de la réponse immunitaire
La réponse immunitaire se déclenche parce que le système immunitaire reçoit des signaux de «danger». En effet, les cellules immunitaires innées capables de reconnaître des PAMPs grâce à leurs PRRs, vont alerter les lymphocytes T et B. La réponse immunitaire ne doit pas se déclencher en présence d’antigènes du soi et en absence de signal de danger (Figure 2).
Lorsqu’un agent pathogène réussit à déjouer les défenses naturelles non spécifiques que sont les barrières cutanées ou muqueuses et les mécanismes de phagocytose naturelle, l’immunité adaptative est alors activée au niveau des tissus lymphoïdes secondaires, en particulier dans la rate, les ganglions lymphatiques ou les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses. Deux situations sont fréquemment observées. (i) L’antigène peut activer directement le BCR des lymphocytes B qui activés, vont devenir des plasmocytes sécrétant des anticorps de type IgM. Ces anticorps agissent principalement en activant le système du complément pour détruire l’antigène. Il s’agit d’une réponse adaptative primaire. (ii) L’antigène sera par la suite présenté aux cellules T par les CPA. En effet, sous l’influence de signaux inflammatoires locaux, les CPA activeront les deux grandes catégories de lymphocytes T effecteurs: les CTL dirigées surtout contre les cellules infectées et les cellules cancéreuses [45].
Les cellules Th jouent un rôle clé dans la coordination de l’immunité humorale ou cellulaire et qui induiront chez les lymphocytes B une différenciation en plasmocytes qui libèrent d’importantes quantités d’anticorps de type IgG, IgA ou IgE et une formation de cellules mémoires. La maturation des cellules mémoires sera observée au bout de 4 à 6 mois après le contact avec l’antigène (Figure 2).
Les cellules Th interviennent aussi dans la régulation de l’action des CTL. Trois types de cellules T effectrices ont été décrits selon le type de cytokines libérées : (i) les cellules Th1 sécrétant principalement de l’IFN-γ, qui stimule la phagocytose, favorise la destruction intracellulaire des micro-organismes, facilite la présentation de l’antigène aux cellules T et participe à la réaction inflammatoire. (ii) Les cellules Th2 stimulant les lymphocytes B et favorisent la production d’anticorps. Elles agissent par le biais surtout d’interleukines comme l’IL-4, l’IL-5 et l’IL-13. (iii) les lymphocytes Th17 qui par la libération de l’IL-17 et l’IL-6 permettent l’induction d’une inflammation locale.
L’immunité adaptative représente, non seulement une protection spécifique contre le non-soi, mais aussi une menace pour le soi car pouvant conduire à l’apparition de maladies inflammatoires et auto-immunes. Il existe ainsi des mécanismes de régulation qui visent à limiter tout dérapage du système immunitaire. En effet, cette régulation est faite aux niveaux centrale et périphérique.
Les réponses cellulaires T sont régulées par une balance entre des signaux activateurs et des signaux régulateurs en périphérie. Celle-ci peut être assurée par les cellules régulatrices ou Treg qui libèrent des cytokines immunorégulatrices comme l’IL-10 et le TGF-β. Ces dernières cellules peuvent également exprimer des récepteurs inhibiteurs.
Plusieurs études réalisées chez des souris ou chez l’homme ont démontré que la suppression de certaines fonctions immunitaires via l’augmentation de signaux inhibiteurs tels que PD-1 contribuait à l’épuisement réversible des réponses T. Ce phénomène est aussi appelé « exhaustion », il est surtout observé dans un contexte d’une exposition antigénique répétée des cellules T [33].
ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE T
Mécanismes d’activation lymphocytaire
L’activation des lymphocytes T résulte de leur interaction spécifique avec l’antigène. Cette interaction est faite via le CMH des CPA et les parties des antigènes reconnues sont appelées épitopes. Le fragment antigénique présenté par la molécule du CMH et reconnu par le TCR est de nature peptidique.
L’activation permet aux lymphocytes matures de passer d’un stade naïf à un stade effecteur (CTL, Th ou Treg) ou au stade de lymphocyte mémoire. Les signaux de stimulation permettront l’activation de facteurs dits de transcription et l’expression de nouvelles molécules nécessaires au fonctionnement des cellules activées. Les lymphocytes T activés acquièrent ainsi des fonctions effectrices avec une plus grande capacité de prolifération.
Activation des lymphocytes T helper
Les lymphocytes Th ou TCD4+ sont activés par des fragments antigéniques présentés avec des molécules CMH-II des CPA. Cette liaison repose sur la formation de la synapse immunologique avec deux types de signaux : des signaux de stimulation et des signaux de co-stimulation. Ils sont tous indispensables à une activation correcte de la cellule T. Ces signaux seront à l’origine d’un phénomène de transduction basée sur la phosphorylation de kinases intra-cellulaires et aboutissant à l’activation de facteurs de transcription en vue de la synthèse de cytokines.
Ainsi à la suite de l’activation, on retrouve successivement deux phases : une première dite de prolifération et une seconde correspondant à la différenciation. La voie de différenciation du lymphocyte activé sera différente suivant la nature des cytokines produites par la CPA. Ces cytokines constituent alors le troisième signal. Encore appelé signal d’orientation, il permet de distinguer différents sous-groupes de lymphocytes Th [42, 44, 78] :
des lymphocytes Th 1 provenant d’une différenciation des Th naïfs (Th0) sous l’influence de cytokines comme l’IL-12 et agissant essentiellement dans la réponse à médiation cellulaire par la libération d’IFN-γ, de TNF-α et d’IL-12. Ces cellules Th1 sont aussi responsables d’une augmentation de l’expression membranaire de molécules de co-stimulation nécessaires à la formation et à l’activation des CTL [32].
des lymphocytes Th 2 issus de la différenciation des Th0 grâce à l’action de l’IL-4, et libérant des interleukines comme IL-4 ; IL-5, IL-13, … Cette sous population permet d’amplifier et d’orienter la réponse lymphocytaire B.
des lymphocytes Th17 obtenus grâce à l’IL-6 et à IL-23, et intervenant par une production d’IL-17 pour le maintien d’une inflammation locale dans les sites de pénétration des antigènes.
Activation des lymphocytes T cytotoxiques
Les lymphocytes T CD8+ sont activés par des fragments antigéniques présentés via les molécules du CMH-I à la surface des CPA. En effet, les lymphocytes T CD8+ circulent à l’état pré-cytotoxique et reçoivent des signaux d’activation pour devenir cytotoxiques. A l’image des cellules Th, on distingue deux types de signaux nécessaires à leur activation :
des signaux de stimulation issus de la reconnaissance spécifique du complexe CMH-I/peptide antigénique par le TCR de la cellule TCD8+. Ces signaux proviennent d’une phosphorylation de protéines intracellulaires par des kinases. C’est-à-dire un mécanisme de transduction dépendant des motifs ITAM [2].
des signaux de co-stimulation constituent le second groupe, ils sont induits par l’interaction entre la molécule CD28 présente à la surface du lymphocyte T et les récepteurs B7.1 et B7.2 exprimés par les CPA.
Il est nécessaire de préciser que la plus part des cellules nucléées ciblées par les CTL expriment des molécules du CMH-I, ce qui facilite l’action des CTL.
Les lymphocytes T cytotoxiques sont responsables de l’immunité cellulaire aboutissant à la mort de la cellule cible. On observe une libération des granules cytotoxiques (lysosomes particuliers) qui contiennent deux catégories de molécules :
la perforine qui est une protéine se polymérisant pour former des pores au niveau de la membrane de la cellule cible ;
des granzymes ayant pour but de détruire l’ADN en activant des caspases qui iront fragmenter l’ADN afin d’induire l’apoptose.
Marqueurs d’activation lymphocytaire T
Marqueurs solubles
Plusieurs marqueurs solubles ont été identifiés, comme la chaine α du récepteur de l’IL-2 (CD25 soluble) mais aussi des cytokines essentiellement produites par les cellules Th activées. Dans de nombreuses études ces marqueurs solubles ont été qualifiés de non spécifiques, c’est le cas des interférons. Toutefois ces marqueurs solubles ont l’avantage d’être faisables même dans des environnements très défavorisés par rapport aux marqueurs cellulaires. Ils peuvent être dosés par la technique ELISA ou système Multiplex [42, 44, 78].
D’autres marqueurs solubles comme la bêta-2-microglobuline (β2m) ont été évoqués surtout dans les pathologies tumorales et infectieuses à l’origine d’une activation immunitaire systémique. La β2m est une protéine de faible poids moléculaire présente à la surface de toutes les cellules nucléées. Elle est physiologiquement libérée dans tous les fluides biologiques à faible et constante concentration: 0,13 mg/kg/ h [35]. Le niveau plasmatique de β2m est facilement mesurable à partir de tout échantillon de sang, mais sa spécificité par rapport à la seule activation des lymphocytes reste à démontrer.
Marqueurs membranaires
Les lymphocytes T activés expriment des molécules sur leurs surfaces cellulaires, ce qui les différencie nettement des lymphocytes T naïfs. Ces molécules comprennent des protéines réceptrices, des molécules co-stimulatrices, des molécules d’adhésion, des récepteurs de chimiokines, et des molécules du CMH.
Exemple du marqueur HLA-DR
Le marqueur HLA-DR est un hétérodimère αβ. La fonction principale de HLA-DR est de présenter des antigènes peptidiques, potentiellement d’origine étrangère et les deux chaînes α et β sont ancrées dans la membrane. Il s’agit d’un récepteur de surface cellulaire codé par le complexe antigène leucocytaire humain sur la région 6p21.31 du chromosome 6. A la surface des cellules, ces molécules HLA-DR sont régulées à la hausse en réponse à la stimulation. En effet, leur expression augmente significativement dans les 48 – 60 h après la stimulation antigénique et sera suivie d’une progression de la réponse immunitaire.
Les CPA sont des cellules exprimant d’emblée les molécules HLA-DR, c’est-à-dire sans stimulation antigénique. Cependant, cette expression augmente en cas d’activation des CPA. Les HLA-DR sont des glycoprotéines de surface cellulaire normalement absentes sur les cellules T au repos, et peuvent représenter un marqueur potentiel de l’activation du système immunitaire, comme a été proposé pour la surveillance post-greffe [64]. Cette hypothèse a été partiellement soutenue par des rapports antérieurs. Les cellules T exprimeraient également les molécules HLA-DR lors de l’activation avec une cinétique plus lente par rapport aux CPA professionnelles [72].
L’expression membranaire des molécules HLA-DR /peptide antigénique par les CPA serait influencée par les interférons, l’IL-2, l’IL-4, des TNF et le GM-CSF. Par contre des cytokines comme les IL-10, 20, 21, 22, 23 agiraient négativement dans cette expression.
Exemple du marqueur CD25
Le CD25 représente la chaîne α du récepteur de l’IL-2. Cette dernière cytokine est produite par les lymphocytes TCD4 et quelques lymphocytes TCD8 activés. Exprimé 12-24 h après stimulation antigénique, CD25 (IL-2Ra) est régulé à la hausse sur les membranes cellulaires pour faciliter la production d’un récepteur IL-2 et donc la prolifération et la différenciation cellulaire [60]. L’IL-2 exerce son action en se fixant sur son récepteur de haute affinité constitué de trois sous-unités: α ou CD25 qui est inductible lors de la liaison de l’IL-2, β ou CD122 qui est un constituant stable des membranes lymphocytaires et γ ou C132 commune à trois autres récepteurs d’interleukines. Ce récepteur est principalement retrouvé à la surface des Treg et des lymphocytes T activés, mais il peut être soluble comme décrit précédemment. En effet, la libération de la chaine α soluble de l’IL-2 (R IL-2s) résulte de l’activation des récepteurs membranaires de l’IL-2 des lymphocytes T après liaison de l’IL-2.Ainsi après liaison de l’IL-2 à son récepteur et activation lymphocytaire, une partie de la sous unité α est libérée de la membrane et constitue un récepteur soluble de l’IL-2. Il semblerait que l’apparition de cette forme soluble dans le sérum soit une conséquence d’une dégradation protéolytique plutôt qu’un mécanisme d’épissage post-transcriptionnel. La concentration sérique de CD25 soluble est généralement considérée comme un marqueur de l’activation des lymphocytes T [92].
Conséquences et étude de l’activation lymphocytaire
L’activation lymphocytaire correspond donc à l’entrée en action des lymphocytes c’est-à-dire le déclenchement de leurs fonctions effectrices. Elle sous-tend toutes les facettes de l’immunité adaptative [56]. Très complexe, elle résulte d’une cascade finement régulée d’événements avec comme conséquence l’expression de plusieurs molécules de surface, la production et la sécrétion de cytokines [73]. Les différentes sous populations lymphocytaires T partagent de nombreux marqueurs et molécules exprimés par les lymphocytes T en faisant la distinction entre l’expression constitutive et l’expression induite (marqueurs d’activation). La stimulation des lymphocytes T conduit à l’expression forte et facilement mesurée de molécules appelées marqueurs d’activation, qui jouent un rôle important dans la réponse immunitaire. Habituellement, les marqueurs d’activation peuvent être directement (en l’absence d’Ag ou de mitogène) régulés par de nombreuses cytokines connues, en raison de la présence constitutive de leurs récepteurs ; dans d’autres cas, les récepteurs sont exprimés de nouveau par stimulation (par exemple IL-12R). L’IL-12, produite par les CPA, augmente la prolifération et l’activité cytolytique des cellules NK et T et stimule l’apparition d’un phénotype TH1 par la sécrétion de cytokines telles que IL-2, IL-3, IL-8, TNF-α, GM -CSF et en particulier IFN-γ. En outre, dans ces travaux, les effets de cette cytokine sur l’expression des autres marqueurs d’activation, ont été examinés. Il s’agit surtout d’une augmentation de l’expression de HLA-DR à la surface des cellules T induite in vitro par trois interleukines: l’IL-2, l’IL-4 et l’IL-12 [83].
Il est maintenant clair que les lymphocytes T récemment activés peuvent présenter des Ag à d’autres cellules T [79], et cette capacité est corrélée avec le taux de synthèse des marqueurs. En plus du génotype CMH, du type de co-stimulateur et de l’affinité TCR, la dose de présentation de peptide antigénique (effet d’avidité) par la CPA a un effet important sur l’orientation de la réponse immunitaire [59].
Il est possible de mesurer quantitativement le nombre de cellules T exprimant des molécules d’activation comme (CD69, CD25, CD71, CD122, HLA-DR) ou des molécules de co-stimulation (CD28, CTLA-4, CD80, CD86), y compris deux marqueurs de cellules T de type CD8 et CD4 [21].
MODULATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE
Pour limiter les conséquences néfastes des réponses immunitaires, il existe des mécanismes de régulation reposant sur l’intervention de cellules ou de molécules immuno-modulatrices. A titre d’exemple, les réponses cellulaires T sont régulées par une balance entre des signaux activateurs et des signaux inhibiteurs. En effet, les lymphocytes T régulateurs sont parmi les acteurs impliqués dans cette immunomodulation. Ils agissent par le truchement de cytokines immuno-régulatrices ou par l’expression de récepteurs inhibiteurs membranaires comme CTLA-4, TIM-3, CD160 ou PD-1. Cette dernière molécule est l’une des plus étudiées.
Immunomodulation dépendante de PD-1
De nombreuses études réalisées à la fois chez les souris ou l’homme ont permis de démontrer que la suppression de certaines fonctions immunitaires dépendait de l’augmentation de signaux inhibiteurs comme PD-1. Dans le contexte d’une exposition antigénique chronique, ce phénomène contribuerait à un épuisement réversible des réponses T et est encore appelé en anglais «T cell exhaustion » [40].
Structure et expression de PD-1
Encore appelé CD160, PD-1 est une glycoprotéine transmembranaire appartenant à la superfamille des immunoglobulines. Son domaine intra-cytoplasmique renferme des motifs de signalisation de type ITIM [22]. Au vue de ces propriétés régulatrices et de la présence de similitudes structurales avec certaines molécules co-réceptrices, PD-1 a été considérée comme étant un co-récepteur à l’image de CD28 et CTLA-4. Mais, contrairement aux autres membres de cette même famille, PD-1 ne contient pas dans sa structure de résidus de cystéine proximale. Cette dernière partie structurale est nécessaire au phénomène d’homo-dimérisation. Certaines études biochimiques ont montré que PD-1 est une protéine monomérique pouvant être retrouvée sous une forme soluble [91]. Il s’agirait d’une molécule exprimée par les thymocytes, au cours du développement intra-thymique [60].
En périphérie, les lymphocytes T naïfs au repos n’expriment pas ou même très faiblement ce marqueur à leur surface. C’est après leur activation via l’interaction TCR/HLA-peptide, que cette expression serait induite de manière transitoire [7, 40]. Ainsi PD-1 augmenterait la susceptibilité des lymphocytes T activés à une inhibition dépendante de l’interaction PD-1/PD-L.
Une étude antérieure ayant été conduite chez l’homme a montré que les cytokines IL-2, IL-7, IL-15 et IL-21 possédant toutes la chaîne γ commune (γc) dans leur structure, sont capables d’induire l’expression de PD-1 à la surface des lymphocytes T périphériques. Ces cytokines pourraient aussi induire l’expression des ligands PD-L sur les monocytes [43]. Cependant, il a été rapportée que cette expression de PD-1 induite par les cytokines, n’entrainait une inhibition fonctionnelle de la cellule T que lorsque le TCR était engagé simultanément [43].
Des mécanismes similaires ont été décrits pour les lymphocytes B [80]. Aussi, les cellules dendritiques, les monocytes/macrophages et les cellules NKT pourraient également surexprimer le marqueur PD-1 au cours de certaines maladies chez l’homme [40, 46, 51, 58, 65, 90].
Grâce à des modèles murins, il a été démontré que l’induction initiale de PD-1 suite à l’activation du TCR est en partie sous la dépendance du facteur de transcription NFATc1 [62].
Différents ligands de PD-1
PD-1 interagit avec deux types ligands : PD-L1 (ou B7-H1 ou CD274) et PD-L2 (ou B7-DC ou CD273). PD-L1 a été découvert en 1999 et identifié comme étant un membre de la famille des B7 [19, 26]. C’est une protéine transmembranaire de type I codée par le gène Cd274 situé sur le chromosome 9 chez l’homme. Elle est composée d’un domaine extracellulaire, un domaine transmembranaire et un domaine intracellulaire dont la voie de signalisation reste encore mal connue [19, 40]. PD-L2 a été découverte en 2001 [49, 84]. Sa structure est proche de celle de PD-L1 et chez l’homme, son gène Pdcd11g2 est aussi situé au niveau du chromosome 9.
Malgré la présence d’homologies structurales, les deux ligands présentent certaines différences concernant leur profil d’expression cellulaire et le résultat de leur liaison avec PD-1. En effet, PD-L1 a une plus large distribution cellulaire chez l’homme. Il peut être exprimé constitutivement ou après stimulation par plusieurs cellules hématopoïétiques dont les monocytes, les cellules dendritiques, les lymphocytes T et B activés [40, 80]. Nombreux sont les stimuli pouvant induire son expression sur ces différentes cellules humaines. Par exemple, la stimulation des TCR et BCR renforcerait son expression par les lymphocytes T et B [80]. L’IL-2, l’IL-7, l’IL-15 et l’IL-21 augmenteraient son expression sur les monocytes. Parmi ces dernières cytokines, seule l’IL-21 n’est pas capable d’induire sa synthèse par les lymphocytes T [43] bien qu’entrainant une forte expression de PD-L1 à la surface des lymphocytes B [43]. Différents types cellulaires non-hématopoïétiques (cellules endothéliales, pulmonaires, kératinocytes, tissus hépatiques…) pourraient également exprimer ce ligand à leur surface [40].
L’expression cellulaire de PD-L2 est beaucoup plus restreinte chez l’homme. Elle serait inductible et limitée à certaines cellules hématopoïétiques comme les cellules dendritiques et les monocytes [40]. Comparée à celle de PD-L1, l’expression de PD-L2 serait modérément induite sur les monocytes par l’IL2, l’IL-15 et l’IL-21 [43]. Au contraire, l’IFN-γ induit une forte expression de PD-L2 comparable à celle de PD-L1 [87]. Des données plus récentes ont montré que PD-L2 est exprimé à la surface des lymphocytes T et B via l’activation des immunorécepteurs [57, 80].
PD-L1 et PD-L2 interagissent avec PD-1 d’une manière compétitive mais avec des mécanismes différents (Figure 3). Certains auteurs suggèrent qu’ils n’ont pas la même affinité pour PD-1. En effet, PD-L2 aurait une affinité trois fois plus forte chez l’homme ; toutefois, les données de la littérature ne sont pas toutes concordantes à ce sujet [14, 29].
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE: RAPPELS
I. RAPPELS SUR LE SYSTEME IMMUNITAIRE
I.1. Composants du système immunitaire
I.1.1. Organes du système immunitaire
I.1.2. Cellules immunitaires
I.2. Déroulement de la réponse immunitaire
II. ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE T
II.1. Mécanismes d’activation lymphocytaire
II.1.1. Activation des lymphocytes T helper
II.1.2. Activation des lymphocytes T cytotoxiques
II.2. Marqueurs d’activation lymphocytaire T
II.2.1. Marqueurs solubles
II.2.2. Marqueurs membranaires
II.2.2.1. Exemple du marqueur HLA-DR
II.2.2.2. Exemple du marqueur CD25
II.3. Conséquences et étude de l’activation lymphocytaire
III. MODULATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE
III.1. Immunomodulation dépendante de PD-1
III.1.1. Structure et expression de PD-1
III.1.2. Différents ligands de PD-1
III.1.3. Voies de signalisation PD-1/PD-L
III.2. Marqueur PD-1 et lymphocytes T régulateurs
III.3. Marqueur PD-1 en pathologies infectieuses
IV. INTERFACE ENVIRONNEMENT/IMMUNITE
IV.1. Hypothèse hygiéniste
IV.2. Notion d’immunité de groupe
I. OBJECTIFS
II. MATERIEL ET METHODES
II.1. Site et cadre d’étude
II.2. Population d’étude
II.3. Considérations éthiques
II.4. Méthodologie et tests biologiques
II.4.1. Recueil des échantillons
II.4.2. Etude des paramètres hématologiques
II.4.3. Isolement et conservation des cellules mononuclées
II.4.3.1. Matériels et consommables
II.4.3.2. Réactifs et adjuvants
II.4.3.3. Principe de la séparation cellulaire
II.4.3.4. II – 4.3.4. Mode opératoire
II.4.4. Congélation des PBMC
II.4.5. Décongélation des PBMC
II.4.5.1. Matériel et consommables
II.4.5.2. Réactifs et adjuvants
II.4.5.3. Mode opératoire
II.4.6. Analyse des cellules par cytométrie en flux
II.4.6.1. Matériels et consommables
II.4.6.2. Réactifs et adjuvants
II.4.6.3. Principe de la cytométrie en flux
II.4.6.4. Mode opératoire
II.4.7. Analyses statistiques des données
III. RESULTATS
III.1. Caractéristiques de la population d’étude
III.1.1. Caractéristiques générales
III.1.2. Caractéristiques biologiques
III.2.1. Variations de l’expression de PD-L1 par les DCs
III.2.2. Comparaison des niveaux d’expression de HLA-DR par les DCs41
III.3. Etude du phénotype fonctionnel des monocytes
III.3.1. Variations des niveaux d’expression de PDL-1 par les monocytes..
III.3.2. Variations des niveaux d’expression de HLA-DR par les monocytes
III.4. Etudes des niveaux d’immunomodulation et d’activation des cellules T
III.4.1. Etude du phénotype fonctionnel des lymphocytes T CD4+
III.4.1.1. Niveaux d’immunomodulation des lymphocytes TCD4
III.4.1.2. Niveaux d’activation lymphocytaire T CD4+
III.4.1.3. Relation entre les niveaux d’activation et d’immunomodulation des lymphocytes T CD4+
III.4.2. Etude du phénotype fonctionnel des lymphocytes T CD8+
III.4.2.1. Niveaux d’immunomodulation des lymphocytes TCD8
III.4.2.2. Niveaux d’activation lymphocytaire T CD8+
III.4.2.3. Corrélation entre activation et immunomodulation des LT CD8+
IV. DISCUSSION
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES
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