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Les procédés d’extraction
Les nombreux procédés utilisés pour l’extraction des HE peuvent être classés en deux catégories :
– les méthodes classiques: entraînement à la vapeur d’eau, hydrodistillatio n, enfleurage, expression, extraction par solvant volatil.
– les méthodes modernes: extraction par CO2 supercritique, distillation assistée au four à microondes.
Extraction par entraînement à la vapeur d’e au19
La majorité des HE est obtenue par distillation à la vapeur d’eau, technique la plus couramment utilisée. Le procédé consiste à faire aversertr une cuve remplie de plantes aromatiques par de la vapeur d’eau. Cette dernière extrait l’essence de la plante et forme avec elle un mélange gazeux homogène. A la sortie de lacuve et sous pression contrôlée, la vapeur d’eau enrichie en vapeur d’HE traverse un serpentin et se condense. Le liquide tombe dans l’essencier (vase florentin) où l’HE (si sa densité est inférieure à celle de l’eau (<1)) flotte sur l’eau de distillation ( hydrolat) et se recueille par débordement.
Hydrodistillation18,20,21
Au cours de ce plus ancien procédé d’extraction, el mélange « eau et matière végétale » est porté à ébullition. Sous l’action dela chaleur, les cellules éclatent et libèrent les composés organiques odorants et volatils. La vapeur d’eau formée entraîne les composés organiques à l’état gazeux vers le réfrigérant. La condensation de ce mélange gazeux provoque sa séparation en deux phases par différence de densité: la phase huileuse (HE) contenant la majorité des composés odorants et la hasep aqueuse (hydrolat ou eau aromatique) qui n’en contient que très peu. Une extraction par hydrodistillation est montrée à la figure 6.
Les procédés traditionnels d’extraction des HE, l’hydrodistillation (Figure 6) et la distillation à la vapeur d’eau sont relativement si mples mais présentent plusieurs inconvénients : durée d’opération longue, consommation énergétique importante, et résidu gorgé d’eau difficile à retraiter. Les risques de dégradation thermique et d’hydrolyse des molécules aromatiques peuvent conférer à l’HE une couleur différente de celle normalement attendue. De plus, ces procédés ne sont pas polyvalents : l’hydrodistillation est généralement réservée aux produits secs (graines, racines, …), l a distillation à la vapeur au produit frais (feuilles, fleurs, …).
La distillation assistée au four à micro-ondes28
Cette technique a été mise au point par GANZER et ollc. et LANE et JENKINS en 1986. Depuis cette date, l’extraction végétale assistée par micro-onde a été le fruit de nombreuses recherches et de brevets. Le matériel végétal est placé dans un réacteur à micro-ondes sans ajout d’eau ou de solvant organique. Le chauffage de l’eau contenue dans la plante permet la rupture des glandes renfermant l’HE. L’HE libérée est ensuite entraînée par la vapeur d’eau produite par la matière végétale. Un ystème de refroidissement à l’extérieur du four micro-ondes permet la condensation du distillat, composé d’eau et d’HE. Une simple décantation permet de recueillir l’HE.
Il existe deux variantes pour ce type d’extraction :
– la distillation par micro-ondes à pression atmosphérique essentiellement pour les matières végétales à teneur en eau > à 80%.
– la distillation par micro-ondes à pression réduite(VMHD) qui s’effectue avec ou sans ajout d’eau respectivement pour les produits secs ou ceux humides.
VMHD : Vacuum Microwave Hydrodistillation.
La distillation par micro-ondes présente les avantages suivants :
– faible risque de dégradation thermique de la matière végétale.
Criblage Phytochimique46,47
Le criblage phytochimique est la première étape del’étude chimique d’une plante. Il est effectué afin d’inventorier les diverses familles de substances naturelles présentes dans la plante comme les alcaloïdes, flavonoïdes et leucoanthocyanes, tanins et polyphénols, triterpènes et stérols insaturés, cardénolides etufadénolides,b hétérosides cyanogénétiques, anthraquinones et stérols insaturés. Le criblage phytochimique ne renseigne pas sur la structure d’une molécule bien déterminée.
La mise en évidence de ces composés fait interveni des réactions chimiques soit de précipitation, soit de coloration, soit les deux.
Les méthodes de détection des diverses familles desubstances naturelles présentes dans la plante sont regroupées dans le tableau 1.
La chromatographie sur couche mince (CCM) 63,64,65
Elle repose principalement sur les phénomènes d’adsorption – solide – liquide -. La CCM est un procédé de microanalyse utilisant une phase stationnaire poreuse le long de laquelle une phase mobile entraîne à vitess e inégale suivant une direction bien déterminée, les substances à séparer. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse par capillarité le long d’une phase stationnaire déposée en un film très adhérent sur une plaque de verre ou sur une feuilled’Aluminium ou de plastique semi-rigide. Après que l’échantillon ait été déposé sur la phasestationnaire, les substances migrent à leur propre vitesse, derrière le front de l’éluant.
La vitesse de migration est fonction de l’affinité des constituants vis-à-vis de la phase liquide mobile et/ou de la phase fixe adhérant au support chromatographique.
Le rapport frontal ou référence frontale (ou retarding factor) Rf est un repère commode de la position d’un composé sur une plaque. Il est donné par l’expression :
Rf =0.
dx : distance parcourue par le composé à partir de la ligne de dépôts.
ds : distance parcourue par l’éluant depuis la ligne de dépôts jusqu’au centre de la tache.
La CCM permet de réaliser :
– le contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé organique.
– le suivi de la progression d’une réaction.
– le contrôle d’une séparation effectuée par chromatographie sur colonne.
– la recherche d’un meilleur éluant avant d’entreprendre une séparation sur colonne (microchromatographie).
– l’identification d’une substance par comparaison de Rf (cochromatographie).
Chromatographie en phase gazeuse (CPG)66,67
Méthode instrumentale, elle permet de séparer des olutés sous forme gazeuse, en fonction de leurs points d’ébullition respectifs. L’échantillon est d’abord vaporisé puis entraîné le long de la phase stationnaire par un flux de gaz neutre (gaz vecteur). La nature de la phase stationnaire permet d’augmenter la sélectivité de la colonne envers les composés à séparer. Il arrive souvent qu’une modification chimique des composés à analyser (dérivation) est nécessaire dans le but de changer leurs propriétés et de les rendre volatils aux températures utilisées en CPG.
Si la phase stationnaire est un liquide non ou peu volatil, il s’agit de chromatographie gaz-liquide (CGL). Si la phase stationnaire est un solide adsorbant, on parle de chromatographie gaz-solide (CGS).
Pour la CPG, l’élution est poursuivie jusqu’à ce que chaque substance soit entraînée hors de la phase stationnaire.
Ce procédé permet une analyse qualitative ou quanti ative d’un mélange complexe, selon le type de colonne utilisé.
La description des six principaux éléments d’un CPG est portée dans l’annexe 4 et la figure 12 illustre un schéma simplifiée d’un CPG.
Spectrophotométrie IRTF
Son principe de fonctionnement est différent de celui d’un spectrophotomètre IR classique. Il ne mesure pas directement le spectre IR d’un composé à analyser.
Le prisme dispersif y fait défaut. Mais un interféromètre optique intercepte le faisceau IR et conduit à la formation de faisceaux polychromatique s qui s’interfèrent. Les faisceaux ainsi produits traversent l’échantillon à analyser avant d’arriver au détecteur. A son issue, un interférogamme est obtenue. Le traitement de ce dernier, qui n’est pas un spectre d’énergie, conduit au spectre IRTF par transformé de Fourier. Le processus de fonctionnement décrit précédemment est représenté sur le schéma 1.
Le spectromètre infrarouge en transformé de Fourie tire son avantage de sa grande sensibilité :
– 2 à 3x plus sensible que celui IR classique -, c ritère nécessaire si l’on souhaite obtenir un spectre à partir d’une très faible quantité d’échantillon (de l’ordre de ng) dans un faible intervalle de temps.
Détermination des caractéristiques chimiques28
Le principe est basé sur la neutralisation des acides libres par une solution éthanolique d’hydroxyde de potassium titrée.
1g d’HE a été dissous dans 5 ml d’éthanol 90% dansun ballon de 100 ml et quelques gouttes de phénolphtaléine y ont été ajoutées puislemélange a été agité soigneusement.
Cette solution a été dosée avec une solution de KOH éthanolique 0,1M jusqu’à obtention d’une coloration rose violacée.
Le ballon et son contenu sont réservés pour la détermination de l’indice d’ester (IE).
L’indice d’acide (IA) d’une HE est exprimé par la relation suivante :
IA =0.
V : volume de la solution de KOH [ml].
m : masse de la prise d’essai [g].
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Table des matières
Chapitre I – Botanique de Cosmos bipinnatus Cav.
I.1. Position systématique
I.2. Description botanique
I.3. Répartition géographique
I.4. Ethnobotanique et utilisation de Cosmos bipinnatus Cav
I.5. Travaux antérieurs
Chapitre II – Les huiles essentielles
II.1. Quelques définitions et quelques propriétés
II.2. Historique
II.3. Les procédés d’extraction
II.3.1. Extraction par entraînement à la vapeur d’eau
II.3.2. Hydrodistillation
II.3.3. L’enfleurage
II.3.4. L’expression à froid
II.3.5. Extraction par solvant volatil
II.3.6. Extraction par CO2 supercritique
II.3.7. La distillation assistée au four à micro-ondes
II.4. Caractéristiques
II.4.1. Caractéristiques organoleptiques
II.4.2. Caractéristiques physiques
II.4.2.1. Densité relative à 20°C – d – NFT75-111
II.4.2.2. Indice de réfraction à 20°C – n- NFT75-112
II.4.2.3. Pouvoir rotatoire -α – NFT75-113
II.4.3. Caractéristiques chimiques 28
II.4.3.1. Indice d’acide -IA- NFT75-103
II.4.3.2. Indice d’ester -IE- NFT75-104
II.4.3.3. Miscibilité à l’éthanol NFT75-101
II.5. Composition chimique
II.5.1. Les terpénoïdes
II.5.2. Les composés aromatiques
II.5.3. Les composés d’origine diverse
II.6. Utilisation des huiles essentielles
II.6.1. En thérapeutie
II.6.2. En parfumerie et cosmétologie
II.6.3. En alimentation
II.6.4. En hygiène
II.7. Quelques familles de plantes à huile essentielle
Chapitre III – Criblage Phytochimique
Chapitre IV – Les méthodes chromatographiques : Identification des constituants d’une huile essentielle
IV.1. La chromatographie sur couche mince (CCM)
IV.2. Chromatographie liquide à basse pression (CLBP)
IV.3. Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
IV.4. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spéctrométrie de masse
IV.4.1. Spéctrométrie de masse
IV.4.2. Couplage CPG/SM
IV.5. Couplage CPG/Spéctrophotométrie Infrarouge en Transformé de Fourrier (CPG/IRTF)
IV.5.1. Spectrophotométrie IR
IV.5.2. Spectrophotométrie IRTF
IV.5.3. Couplage CPG/IRTF
MATERIELS ET METHODES
Chapitre V – Matériels
V.1. Matériel végétal
V.2. Matériels de laboratoire
V.2.1. Pesées
V.2.2. Extractions
V.2.3. Evaporations
V.2.4. Densité relative
V.2.5. Mesure de l’indice de réfraction
V.2.6. Pouvoir rotatoire
V.2.7. La verrerie courante de laboratoire
V.2.8. Analyses chromatographiques
Chapitre VI – Méthodes
VI.1. Extraction de l’HE
VI.2. Détermination des caractéristiques physiques
VI.2.1. Densité relative à 20°C – d – NF T 75-111
VI.2.2. Indice de réfraction – n – NF T 75-112
VI.2.3. Pouvoir rotatoire – α – NF T 75-113
VI.3. Détermination des caractéristiques chimiques
VI.3.1. Indice d’acidité – IA – NF T 75-103
VI.3.2. Indice d’ester – IE – NF T 75-104
VI.3.3.Miscibilité à l’éthanol – NF T 75-101
VI.4. Méthodes chromatographiques
VI.4.1. Chromatographie sur couche mince – CCM –
VI.4.2. Chromatographie liquide à basse pression – CLBP –
VI.4.3. Chromatographie en phase gazeuse – CPG –
VI.4.4. Analyse en CPG/SM
VI.4.5. Analyse en CPG/IRTF
VI.5. Criblage phytochimique
VI.6. Essai d’isolement de constituant d’HE de Cosmos bipinnatus Cav.
VI.6.1. Fractionnement de l’HET par CC en mode gradient de solvant
VI.6.2. Traitement de la fraction F7 à l’Et2O
VI.6.3. Isolement de F731
VI.6.4. Analyse du produit F731
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Chapitre VII – Extraction, fractionnement et analyses de l’HE de Cosmos bipinnatus Cav.
VII.1. Extractions
VII.2. Caractéristiques organoleptiques
VII.3. Caractéristiques physico-chimiques
VII.3.1. Caractéristiques physiques
VII.3.2. Caractéristiques chimiques
VII.4. Analyse chromatographiques de l’HET de Cosmos bipinnatus Cav.
VII.4.1. Analyse en CCM de l’HET de Cosmos bipinnatus Cav.
VII.4.2. Analyse en CLBP : fractionnement en HY et PO de l’HET de Cosmos bipinnatus Cav.
VII.4.3. Analyse en CPG
VII.4.4. Analyse en CPG/SM
VII.4.5. Analyse en CPG/IRTF
VII.5. Interprétations de spectres de masse
VII.6. Criblage phytochimique
VII.7. Essai d’isolement d’un constituant de l’HE
VII.7.1. Résultats du fractionnement de l’HE
VII.7.2. Résultat de l’analyse en CCM de la sous-fraction F73
VII.7.3. Résultats de l’analyse en CCM et en CPG du composé F731
VIII.1. Définition
VIII.2. Les souches microbiennes
VIII.2.1. La souche fongique
VIII.2.2. Les souches bactériennes
VIII.3. Les milieux de culture
VIII.4. Les instruments de stérilisation
IX. Mise en évidence de l’activité anti-microbienne de l’HE de Cosmos bipinnatus Cav.
IX.1. Méthodes
IX.2. Résultats et interprétation
CULTURE ET PRESERVATION DES CHAMPIGNONS ENDOPHYTIQUES DE LA RACINE DE Cosmos bipinnatus Cav.
X.1. Importance des champignons
X.2. Les champignons endophytiques
X.2.1. Répartition botanique
X.2.2. Méthodes de culture, purification et préservation des champignons endophytiques
X.3. Matériels
X.3.1. Matériel végétal
X.3.2. Matériels de laboratoire
X.4. Méthodes
X.4.1. Préparation de la racine et culture
X.4.2. Purification
X.4.3. Préservation
X.5. Résultats et interprétation
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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