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Les enzymes lipolytiques
Définitions et caractéristiques :
Les enzymes lipolytiques forment une classe d’enzymes parfaitement solubles dans l’eau. Elles sont responsables de l’hydrolyse des lipides. Elles agissent sur des substrats lipidiques insolubles dans l’eau mais qui s’organisent spontanément au contact de l’eau pour former des émulsions, des micelles, des liposomes ou des films mono moléculaires [3].
Les carboxylestérases (Carboxyl ester hydrolase) comprennent deux groupes d’enzymes, à savoir non spécifiques estérases (E C 3.1.1.1) et les lipases (E C 3.1.1.3) qui ont été différenciés sur la base de leur spécificité de substrat. Les estérases hydrolysent des solutions d’esters de chaîne acyl court soluble dans l’eau et sont inactifs contre les triacylglycérols à longue chaîne insoluble dans l’eau [22] [146]. Elles sont localisées dans le réticulum endoplasmique et dans le cytosol de différents tissus, mais elles sont abondantes dans le foie. Elles ont une large spécificité en substrat : amides, esters, thioesters et hydrolyse un grand nombre des composés de différentes structures. Elles ont un rô le important dans l élimination des produits toxiques et xénobiotiques [71].
Les lipases font partie de la classe des hydrolases d esters carboxyliques, elles sont largement présentes chez les plantes et chez les animaux ainsi que chez les microorganismes [41]. Ces enzymes appartiennent au groupe des sérines hydrolases et n exigent la présence d aucun cofacteur nécessitant la régénération pour leur activité [121] [34].
D après Jaeger et al. (2002); Les lipases sont définies comme étant des carboxyl-estérases catalysant l’hydrolyse et la synthèse d’esters formés de glycérine et des acides gras de longues chaînes [37]. Ces enzymes présentent une grande spécificité au substrat et dégradent souvent des esters du p-nitrophenyl de l’acyle, Tweens et phospholipides avec la sélectivité vis-à-vis de position, stéréo, et de la longueur de chaîne. Les lipases ressemblent aux estérases, mais elles se diffèrent par leur capacité d’agir sur les esters insolubles dans l’eau [45] [98].
Contrairement aux estérases qui ont un comportement cinétique de Michaelis, les lipases sont faiblement actives en présence d une solution monomérique vraie d esters. Quand on augmente la concentration en substrat, l activité de la lipase est considérablement accrue avec un substrat insoluble (comme l émulsion). Les lipases ont été définies également comme une catégorie spéciale d estérases efficaces dans l hydrolyse de molécules agrégées [5] [121] .
Les lipases catalysent, à l interface eau – lipide, l hydrolyse des liaisons esters formées par des acides gras et du glycérol [36] [37]. Dans le milieu eau /solvant organique immiscible, elles sont également capable de catalyser la réaction réversible de synthèse et échangeuse de groupes d esters et résolution de mélange racémique en alcools et acides optiquement actives (Figure 1). Certaines lipases sont capables d’hydrolyser des phospholipides, des esters de cholestérol et même parfois certains esters synthétiques [41] [5].
L’estérase au contraire agit sur les esters dissous et elle est incapable d’attaquer les esters émulsifies [71]. L’étude de ces enzymes a contribué à l’élaboration d’une enzymologie interfaciale, la catalyse se produit en milieu hétérogène à l’interface huile-eau. Il en résulte que les propriétés biochimiques de ces enzymes dépendent autant de la qualité de cette interface que de certains paramètres classiques tels que le pH ou la force ionique [3].
Les lipases et les estérases sont des biocatalyseurs importants et sont particulièrement adaptés pour des applications industrielles, comme ils sont très stables et actif dans des solvants organiques [86].
Origines des lipases
Les lipases sont largement répondues dans la nature où elles ont un rô le physiologique important dans le métabolisme des graisses. On les retrouve aussi bien dan le règne végétal ; chez les invertébrés et les vertébrés mais également chez des nombreux microorganismes, principalement sous forme de protéines extracellulaires [71] [5].
Les lipases végétales
Les lipases sont largement répondues au sein de la plante bien qu on les retrouve principalement dans les graines où les triglycérides sont stockés dans des structures intracellulaires appelées oléosomes (oil bodies). Sous l action de lipase ces triglycérides sont hydrolysés sous forme d’acides gras dont le rô le est de fournir l’énergie nécessaire à la germination de la graine et au développement de la jeune plante [5].
Les lipases végétales peuvent être classées en trois grands groupes. Le premier groupe est constitué par les triacylglycérols hydrolases qui sont principalement présentes dans les graines. Leur étude revêt une importance économique capitale puisqu’elles sont responsables en grande partie de l’altération des graines pendant le stockage. Les constituants du second groupe, dénommés acylhydrolases, sont présents dans divers tissus de la plante. Ces enzymes présentent peu de spécificité pour leur substrat ; elles sont incapables d’hydrolyser les triglycérides mais elles peuvent catalyser certaines réactions de transestérification. Les principales acylhydrolases sont les phospholipases A et B ; les glycolipases, les sulfolipases et les monoglycérides lipases. Le troisième groupe est constitué par les phospholipases C et D [147].
Les lipases végétales interviennent également dans le métabolisme, le réarrangement et la dégradation de la chlorophylle lors de la croissance et de la sénescence des feuilles ainsi que dans le processus de mû rissement des fruits. Par exemple, les chlorophylases (chlorophylle-chlorophylido hydrolases), présentes dans la membrane des thylakoïdes des chloroplastes, interviennent dans le catabolisme de la chlorophylle. Chez les plantes supérieures, les lipases interviennent dans la biosynthèse de transducteur intervenant dans les mécanismes de régulation ou de défense contre une variété de pathogènes. En effet, les oxylipines octadécanoïques telles que l’acide jasmonique sont synthétisées à partir d’acides gras, notamment d’acide linolénique, en présence de lipases membranaires. Certaines protéines végétales possédant une activité lipolytique peuvent avoir un effet cytotoxique pour les cellules animales. Par exemple, la ricine, une glycoprotéine isolée de la graine de Ricinus communis, induit le blocage de la synthèse des protéines par inactivation des ribosomes. Leur étude a permis leur utilisation comme immunotoxines dans le traitement de certains cancers [5].
D’un point de vue industriel, l’intérêt des lipases végétales n’a cessé de s’accroître depuis quelques années, notamment dans le domaine de la biotransformation de lipides. En effet, les lipases végétales sont facilement isolées à partir de graines et elles présentent des spécificités de substrat atypique comparées aux lipases microbiennes. Par exemple, la lipase des graines de colza (Brassica napus), obtenue par simple homogénéisation de graine dans un tampon adéquat, est utilisée industriellement dans la modification d’huile de tournesol ou dans l’enrichissement de l’huile de primevère en acide -linolénique [147] [5].
Les lipases de mammifères :
Les lipides constituent pour les mammifères une source énergétique essentielle et avantageuse de par leur faible densité. Chez l’homme, ainsi que chez d’autres vertébrés, les lipases interviennent dans le contrô le de la digestion, de l’absorption et de la reconstitution des graisses. Les lipases de mammifères peuvent être classées en trois groupes. Le premier est constitué par les lipases associées à la digestion, telles que les lipases linguale, pharyngale, gastrique et pancréatique. Le second groupe correspond aux lipases présentes dans le cerveau, les muscles, les artères, les reins, la rate, la langue, le foie et les tissus adipeux. Le troisième groupe correspond aux lipases produites par les glandes galactogènes produisant le lait maternel. En effet, les lipases jouent un rô le important dans la digestion chez le nouveau-né dont l’alimentation est riche en lipides. Les tissus adipeux contiennent également une lipase hormonosensible qui est activée par les hormones lipolytiques, telles que le glucagon, via un mécanisme de phosphorylation et déphosphorylation spécifique dépendant de l’AMP cyclique [42] [5].
Les lipides de mammifères les plus étudiées sont les lipases liées à la digestion des graisses et leur absorption. Il s agit de la lipase gastrique, de la lipase pancréatique, de la lipoprotéine lipases et de la lipase hépatique. Des études de la structure de leurs gènes suggèrent que ces différents enzymes dérivent d un ancêtre commun [5].
Les lipases gastriques :
La lipase gastrique, secrétée par la muqueuse gastrique, hydrolyse les lipides alimentaires dans l estomac. Elle ne nécessite pas la présence de cofacteurs pour être active ; elle est stable et active à des valeurs de pH proche de 1 et elle est résistante à la pepsine ainsi qu aux protéases gastriques [146].
Les lipases pancréatiques :
La lipase pancréatique est le principal enzyme responsable de la digestion des lipides alimentaires. Elle agit principalement sur les diglycérides libérés par la lipase gastrique. Elle est secrétée dans le duodénum et fonctionne à des pH légèrement alcalins, contrairement à la lipase gastrique. Au niveau jéjunal, les sels biliaires émulsifient les triglycérides alimentaires liposolubles, afin de permettre à la lipase pancréatique hydrosoluble d agir sur l interface lipide-eau. Il se produit ainsi une lipolyse destinée à permettre la réso rption intestinale des graisses [42].
Les produits de la lipolyse sont, suite à son action, véhiculés à l aide des agents tensioactifs naturels que sont les sels biliaires. L activité de la lipase pancréatique peut s exercer en présence ou en absence des sels biliaires. En leur présence, la lipase s adsorbe d abord à l interface lipide / eau avant d hydrolyser les esters carboxyliques [142].
Par contre, en présence de ces sels biliaires, la lipase pancréatique est inactive, mais son activité est restaurée par un cofacteur protéique appelé colipase. Les sels biliaires sont essentiels pour l assimilation des lipides. En effet, sans l interface eau/lipide de l émulsion formée avec les sels biliaires, la lipolyse des triglycérides serait 2 à 4 fois moins efficace [42] [140].
La lipoprotéine lipase :
Elle joue un rô le dans le métabolisme intermédiaire des lipides. Elle permet l hydrolyse et l adsorption, par les tissus, des triglycérides transportés dans le sang sous forme de lipoprotéines (VLDL, LDL, HDL) [145].
La lipase hépatique :
Elle joue également un rô le dans le métabolisme des lipoprotéines circulant dans le sang. Elle est capable d hydrolyser les glycérides, les phospholipides, et les esters de cholestérol. Elle peut aussi catalyser la transestérification entre glycérides [5].
Les lipases microbiennes :
Les lipases sont largement répondues chez les bactéries, les levures et les champignons filamenteux. Elles sont aussi bien produites chez les bactéries Gram (+) telles que celles de genres Bacillus et Staphylococcus que par des bactéries Gram ( ) telles que Pseudomonas. Elles sont également largement répondues chez les levures du genre Candida ou Geotricum ainsi que chez les champignons filamenteux tels que Rhizopus ou Thermomyces [136].
L intérêt des lipases microbiennes n a cessé de s accroître au cours de ces dernières années, principalement en raison du grand nombre d application qu elles offrent dans des domaines très variés [2]. Les lipases microbiennes présentent comme avantages d une part, d avoir des procédés de fabrication relativement simples comparés aux lipases d origine animal et d autre part, d avoir une grande stabilité vis-à-vis de la température, des détergents et des enzymes protéolytiques. Ces caractéristiques ont permis le développement de nombreuses applications pour les lipases microbiennes qui ont abouti à de nombreux produits commerciaux [1] [44].
Les cutinases :
Les cutinases sont des enzymes produites par différents champignons pathogènes et phytopathogènes tels que Fusarium solani, qui est l agent responsable de la formation de mycétome chez l homme ou tels que Fusarium oxysporum radicis-lycopersici qui est responsable de la pourriture de la racine et du collet chez de tomate et certaines céréales. Elles sont des enzymes qui peuvent être apparentées aux lipases et estérases à la différence qu elles ne nécessitent pas d activation interfaciale pour être efficaces. Comme elles sont actives aussi bien en solution moléculaire vraie qu en système bi phasique, les cutinases sont en quelque sorte le lien entre estérases et lipases [79] [5].
Les cutinases sont capables de dégrader la cuticule des végétaux en clivant les liaisons esters des polymères de cutine. Elles sont également capables d hydrolyser des triglycérides à courtes chaînes d acides gras avec une efficacité comparable à celle de lipase pancréatique [135].
Classification des lipases bactériennes :
Les lipases microbiennes ont été regroupées en plusieurs sous-familles sur la base de leurs séquences en acides aminés ainsi que des propriétés biologiques fondamentales [53]. Cette classification permet de prédire les caractéristiques structurales comme les résidus du site catalytique ou la présence de ponts disulfures, le mécanisme de sécrétion et l exigence d une protéine chaperonne spécifique à certaines lipases, et les relations potentielles avec d autres familles d enzymes [43]. Elle permet aussi une identification plus facile et plus rapide de nouvelles enzymes lipolytiques microbiennes [142].
Cependant la découverte constante de nouvelles lipases ainsi que leurs caractérisations conduiront à l évolution de cette classification. Récemment, l analyse de la relation séquence-structure fonction de 1367 séquences protéiques correspondant aux 80 6 lipases répertoriées dans la base de données LED (lipase Engineering Database) à permis de les classer en 16 superfamilles et 38 familles homologues [43] [5]. Dans cette banque de données sont intégrées des informations sur la séquence, la structure et la fonction des lipases, des estérases et des protéines apparentées [82] [142] ( Tableau 1).
La famille I : elle comprend un total de 22 membres divisé en 7 sous-familles [44]. Les sous-familles I-1 et I-2 : les lipases de Pseudomonas de groupe I et II sont codées ensemble dans un opéron avec leur analogue chaperonne intramoléculaire qui ont été désignés Lif (lipase spécifique foldases) [1].
Ces lipases sont secrétées via le chemin de type II tandis que ceux appartenant à la sous -famill I-3 utilisent le chemin de sécrétion de type I [48].
Les lipases de Bacillus regroupées en sous-famille I-4 sont les plus petites connues avec une masse moléculaire de 19.6 KDa. Elles semblent être bien adaptées pour les applications de la biotechnolog ie c est comme la lipase de B. thermocatenulatus appartenant à la sous-famille I-5 [114]. La lipase de Staphylococcus hyicus et S. aureus appartiennent aux meilleures lipases provenant des bactéries Gram positives [82] [138].
La famille II : elle a été décrite auparavant comme une nouvelle famille des enzymes lipolytiques avec une fonction inconnue. Jaeger K. E. et al. (1993) ont ajouté à cette famille l estérase qui est située dans la membrane externe de P. aeruginosa [52].
La famille III : Les membres de famille III contiennent les lipases extracellulaires de Streptomyces sp. et la souche psychrophile de Moraxella sp. [51].
La famille IV : Les membres de cette famille appartiennent au groupe de lipases de bactéries psychrophiles adaptées au froid (Moraxella sp, Pseudomonas sp) [54], Leurs lipases montrent une similitude aux lipases de mammifères sensibles aux hormones. La famille V présente des analogies structurelles aux : déhalogénases, haloperoxydases et époxydes hydrolases, qui exprime probablement le plie / hydrolases comme une caractéristique de structure tertiaire [82].
La famille VI : Elle classe les estérases qui ont été identifiées à partir de séquences génomiques (Synevhocystis sp, chlamydia trachomatis). Ces petites protéines sont probablement situées dans le cytoplasme bactérien avec une similarité au lysophospholipases de mammalien [82].
Lipases comme biocatalyseurs :
Les lipases peuvent catalyser un grand nombre de réactions allant de l’hydrolyse à l’estérification sans oublier les réactions d’alcoolyse et d’acidolyse. Cette particularité des lipases de catalyser diverses réactions en fonction du microenvironnement de l’enzyme, ainsi que leurs spécificités et leurs conditions douces de réactions, les rendent intéressantes du point de vue industriel [5] [37]. Les lipases ont également la capacité de réaliser des réactions de synthèse tel que l’estérification (réaction entre un acide et un alcool), la transestérification (ester et alcool) et l’interestérification (ester et ester) ainsi que dans des réactions de transfert du groupement acyle d’un ester sur d’autres, nucléophiles tels que des amines ou des thiols (Figure 3) [112].
Réaction d hydrolyse :
L’hydrolyse de triglycérides en acides gras et en glycérol constitue une réaction importante dans les processus industriels des huiles naturelles et des graisses. L hydrolyse permet la production d acides gras pouvant être convertis en alcool gras, ou employés dans des réactions d estérification ou de transestérification [82] [38].
Réaction de synthèse :
En plus de leur fonction naturelle d hydrolyse, les lipases possèdent également la capacité de synthétiser des esters : la quantité d eau du milieu détermine le type de la réaction favorisée. Dans les réactions d estérification à l aide de biocatalyseurs, l eau est un produit de la réaction. A partir d’une certaine teneur, elle affecte l’équilibre de la réaction entraînant la réaction inverse : l’hydrolyse [1] [54].
La transestérification :
La transestérification comprend trois réactions qui sont: interestérification, alcoolyse et acidolyse. Elle implique la réaction d’un groupe acyle avec un alcool (alcoolyse) ou avec le glycérol (glycérolyse) [37] [38].
Interestérification :
Lors de la réaction d interestérification un groupe acyle est transféré à un acide gras (acidolyse) ou à un ester d’acide gras [1]. Certaines huiles végétales, comme par exemple l huile de palme et l huile d amande douce, présentent des limites d applications à cause de leur teneur élevée en acides gras saturés qui sont associés aux maladies cardio- vasculaires. Pour élargir leur utilisation commerciale ces huiles végétales peuvent être modifiées physiquement (par fractionnement) ou chimiquement, par mélange avec d autres huiles ou par traitement enzymatique (interestérification). De telles modifications des huiles et des matières grasses permettent également aux industries de répondre à la demande des consommateurs en produits plus sains [47] [112].
L utilisation des solvants en interestérification nécessite une désodorisation du produit final, en revanche l interestérification enzymatique réalisée en absence de solvants organiques, est une très bonne alternative. De plus l utilisation de lipases spécifiques des positions sn 1 et sn 3 des triglycérides, permet d obtenir des produits avec des caractéristiques qui ne pourraient pas être obtenues par interestérification chimique [38].
B) Alcoolyse : C est une réaction d’un ester avec un alcool monovalent tel que l’éthanol et butanol ou un alcool polyvalent tel que la glycérine pour produire un ester avec des différents groupes d alkyl [112] [81].
c) Acidolyse : C est une réaction d’un ester avec un acide qui mène à un changement de groupe acyle (un groupe acyle est transféré à un acide gras) [81].
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Table des matières
Liste des abréviations
1. Introduction
2. Généralité
2.1. Les enzymes lipolytiques
2.1.1. Définitions et caractéristiques
2.2. Origines de lipase
2.2.1. Les lipases végétales
2.2.2. Les lipases de mammifères
2.2.2.1. Les lipases gastriques
2.2.2.2. Les lipases pancréatiques
2.2.2.3. La lipoprotéine lipase
2.2.2.4. La lipase hépatique
2.2.3. les lipases microbiennes
2.2.4. Les cutinases «Les lipases fongiques »
2.3. Classification des lipases bactériennes
2.4. Lipases comme biocatalyseurs
2.4.1. Réaction d hydrolyse
2.4.2. Réaction de synthèse
2.4.2.1. La transestérification
2.5. Spécificité des lipases
2.6. Séquence, structure et mécanisme d hydrolyse
2.6.1. Les / hydrolases
2.6.2. Mécanismes enzymatiques d hydrolyse
2.6.3. Cinétique d hydrolyse
2.6.3.1. L activation interfaciale des enzymes lipolytiques
2.7. Facteurs influençant la production de lipase
2.7.1. Effet du pH et de la température sur les lipases
2.7.2. Stabilité en solvant organique
2.7.3. Effet d’ions du métal .
2.8. Microorganismes producteurs de lipases
2.9. Applications biotechnologiques de lipase
2.9.1. Les lipases en tant qu hydrolases
2.9.1.1. Applications dans l industrie agro-alimentaire
2.9.1.2. Applications dans les détergents
2.9.1.3. Applications en bioremédiation
2.9.1.4 Applications en tannerie
2.9.1.5 Applications dans l industrie du papier
2.9.2. En synthèse organique
2.9.2.1. Lipases en industries cosmétique
2.9.2.2 Application médicinale et pharmaceutique
2.9.2.3. Résolution de mélanges racémiques
2.9.2.4. Production de polymères biodégradables
3. MATERIELS ET METHODES
3.1. Screening de microorganismes producteurs de lipase
3.1.1. Prélèvements et échantillonnages
3.1.2. Isolements des bactéries lipolytiques
3.1.2.1. Isolement des bactéries lipolytiques à partir des échantillons de sols
3.1.2.2. Isolement des bactéries lipolytiques à partir des échantillons d huile .
3.1.3. Production de lipase .
3.1.3.1. Culture en milieu liquide
3.1.4. Etude de la croissance bactérienne
3.1.5. Etude de l activité lipolytique en fonction du substrat
3.1.6. Mise en évidence de l activité lipasique
3.1.6. 1. Sur milieu gélosé à base de tributyrine
3.1.6. 2. Sur milieu gélosé à base de Tween 80
3.1.7. Dosage de l activité lipasique
3.1.7.1. Dosage de l activité lipasique par titration des AG
3.1.7.2. Dosage de l activité lipasique par colorimétrie
3.1.8. Mesure de l activité émulsifiante
3.1.9. Effet de la lipase sur l adhésion du biofilm d Acinetobacter baumannii
3.1.10. Identification des souches bactériennes productrices de lipases
4. RESULTATS ET DESCUSSION
4.1. Résultats du screening de souches bactériennes productrices de lipases
4.2. Etude de la croissance des souches isolées en présence du substrat
4.3. Effet de la concentration du substrat sur la croissance bactérienne
4.5. Etude de l activité lipolytique en fonction du substrat
4.6. Mise en évidence de l activité lipasique
4.6.1. Sur milieu gélosé .
4.6.1. 1. Milieu gélosé à base de Tributyrine
4.6.1. 2. Milieu gélosé à base de Tween 80
4.7. Dosage de l activité lipasique
4.7.1. Dosage par titration
4.7.2. Dosage par colorimétrie
4.8. Mesure de l activité émulsifiante
4.9. Effet de l action des lipases sur l adhésion bactériennes
Conclusion
Résumé
Références bibliographiques
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