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MÉTHODES
Extraction de l’huile essentielle
Les extractions ont été immédiatement effectuées après la récolte.
Les techniques d’extraction des HE employées dépendent à la fois du type de plantes utilisées et des propriétés physico-chimiques de l’huile essentielle produite. Les méthodes d’extraction les plus utilisées sont :
– L’entrainement à la vapeur : Trois variantes sont possibles selon la texture et la fragilité de la matière première à traiter : l’hydrodistillation, l’hydrodiffusion et la distillation à vapeur saturée,
– L’expression,
– L’enfleurage,
– L’extraction par solvants,
– L’extraction par le gaz carbonique supercritique.
Les HE étant très peu solubles dans l’eau, la méthode que nous avons utilisée pour l’extraction est l’hydrodistillation simple avec un essencier à huile légère de type CLEVENGER.
Les feuilles fraiches de H. faradifani préalablement broyées sont introduites dans un ballon rempli d’eau au 2/3. Le broyat est totalement immergé dans l’eau.
Après ajout de 3 grains de pierre ponce pour régulariser l’ébullition de l’eau, un essencier à huile essentielle légère surmonté d’un réfrigérant à boules est adapté au ballon. L’ensemble est ensuite porté progressivement à ébullition.
L’huile essentielle est entrainée par la vapeur d’eau. Elle est récupérée avec de l’eau dans la partie graduée de l’essencier, après condensation des vapeurs qui s’échappent, mais en phase distincte de l’eau puisqu’elles sont non miscibles. La séparation se fait donc par différence de densité. L’huile surnage, l’eau retourne dans le ballon par système de cohobation continue.
L’avantage de cette technique réside dans le fait que l’huile essentielle n’a pas besoin d’être chauffée jusqu’à sa température d’ébullition pour pouvoir être entraînée sous forme de vapeur; la pression partielle de cette dernière est inférieure à la pression atmosphérique et le complément de pression est fourni par la vapeur d’eau.
La première goutte a été recueillie 40 mn après le début de l’opération. Nous avons épuisé totalement l’huile dans la plante après 3 h d’extraction.
Plusieurs extractions ont été effectuées pour chaque récolte.
Détermination des caractéristiques
Les HE se distinguent les unes des autres par leurs caractéristiques organoleptiques, physiques et chimiques.
Caractéristiques organoleptiques
Elles regroupent l’odeur, la couleur et l’aspect. L’odeur est basée sur trois notes distinctes : la note de tête qui se perçoit à l’ouverture du flacon, celle du cœur qui est l’odeur caractéristique de HE et celle du fond qui met plus de temps à se dégager. La couleur est définie à l’œil nu.
Caractéristiques physiques
Pour une bonne fiabilité des résultats, 2 mesures au moins ont été effectuées pour chaque manipulation.
Liquides à température ambiante, les huiles essentielles sont volatiles. Leur densité est en général inférieure à celle de l’eau. Elles ont un indice de réfraction élevé et la plupart dévient la lumière polarisée.
Les caractéristiques physiques ont été déterminées suivant les normes Afnor.
Mesure de la densité relative à 20°C – NF T 75-111
La densité relative à 20°C d’une HE est le rapport de la masse d’un certain volume d’HE à 20°C à la masse du même volume d’eau distillée à 20°C.
Si m0 (g) est la masse du pycnomètre à vide,
m1(g) : masse du pycnomètre rempli d’eau distillée,
m2(g) : masse du pycnomètre rempli d’HE,
la densité relative est donnée par la formule :
Un pycnomètre de 5 ml est lavé à l’eau distillée puis séché à l’étuve. Sa masse à vide m0 est mesurée à l’aide d’une balance de précision. Après l’avoir rempli d’eau jusqu’au trait de jauge puis porté à 20°C dans un bain thermostaté, nous mesurons à nouveau sa masse (m1). Les mêmes opérations sont effectuées avec le pycnomètre, préalablement séché à l’étuve, puis rempli d’HE (m2)
Mesure de l’indice de réfraction ( n20D ) – NF T 75-112
L’indice de réfraction d’une HE est le rapport entre le sinus de l’angle d’incidence et le sinus de l’angle de réfraction d’un rayon lumineux de longueur d’onde déterminée passant de l’air dans HE maintenue à une température constante. La longueur d’onde spécifiée correspond aux radiations D du sodium ( 0,3nm). Si la lecture est effectuée à une température t’, et t la température de référence, l’indice de réfraction à la température de référence est donnée par la relation :
22AFNOR., 1986. Recueil des Normes Français, huiles essentielles, deuxième édition, Paris.
23AFNOR, 1982, Recueil des normes françaises sur les huiles essentielles, T75-104
Avant la mesure, les prismes du réfractomètre sont lavés à l’alcool. Trois gouttes de HE préalablement filtré sur du sulfate de sodium anhydre sont ensuite déposées entre les deux prismes. La mesure est effectuée quand la frange nette se trouve au milieu du réticulé.
Pouvoir rotatoire (20 ) – NF T 75-113
Le pouvoir rotatoire d’une HE est l’angle dont tourne le plan de polarisation d’une radiation lumineuse de longueur d’onde = (589,3 0,3nm) correspondant aux raies D du sodium, lorsque celles-ci traversent une épaisseur de 10 cm d’HE dans des conditions déterminées de température.
Le pouvoir rotatoire est donné par la relation : 100
A : valeur de l’angle de rotation [°]
L : longueur du tube utilisé (l = 5 cm)
Un tube polarimétrique soigneusement rempli d’HE et exempt de bulle d’air est introduit dans le polarimètre. Après une attente de 15 mn environ, l’angle de rotation dextrogyre ou levogyre de l’échantillon est lu directement lorsque la position d’équilibre entre les plages claire et sombre est obtenue.
Caractéristiques chimiques
Comme pour les caractéristiques physiques, la détermination des caractéristiques chimiques ont été effectuées suivant les normes Afnor.
Indice d’acide (IA) – NF T 75-103
L’indice d’acide IA est le nombre en milligramme d’hydroxyde de potassium nécessaire à la neutralisation des acides libres dans 1g d’HE. Le principe est basé sur la neutralisation des acides libres par une solution de KOH titrée. L’indice est donné par la formule :
V(ml) : volume de la solution de KOH
m (g) : masse de la prise d’essai
Dans un ballon de 100 ml, 1 g d’HE de Helichrysum faradifani est dissous dans 5 ml d’EtOH 90 %. 5 gouttes de phénolphtaléine sont ensuite ajoutées. La solution est incolore. On ajoute goutte à goutte la solution de potasse éthanolique 0,1 M contenue dans la burette jusqu’au virage de l’indicateur coloré au rose violacé.
Indice d’ester (IE) – NFT 75-104
L’indice d’ester IE est le nombre en milligramme d’hydroxyde de potassium nécessaire à la neutralisation des acides libérés par l’hydrolyse des esters contenus dans 1g d’HE. Le principe est basé sur l’hydrolyse des esters par chauffage en présence d’une solution éthanolique titrée de KOH et le dosage de l’excès de la base par une solution titrée de HCl. L’indice est donné par la relation :
Vo(ml) : volume de la solution HCl utilisé pour l’essai à blanc
V1(ml): volume de la solution HCl utilisé pour la détermination
m(g): masse de la prise d’essai
IA : valeur de l’indice d’acide déterminé ( NFT 75 103)
Dans le ballon contenant la solution provenant de la détermination de l’indice d’acide, 25ml de KOH 0,5M et quelques grains de pierres ponces sont introduits. Le mélange réactionnel est porté à reflux pendant 1h. Après refroidissement, 20 ml d’eau distillée et 5 gouttes de phénolphtaléine sont ajoutées. L’excès de KOH est titré avec une solution HCl 0,5N. La fin du dosage est indiquée par le virage au jaune de l’indicateur coloré.
Dans les mêmes conditions, un essai à blanc est effectué mais 5 ml d’éthanol sont ajoutés avant les 25 ml de KOH 0,5M.
Miscibilité à l’éthanol
1 ml d’HE porté à 20°C est introduit dans une fiole de 50 ml. A l’aide d’une burette graduée, de l’éthanol est ajouté goutte à goutte jusqu’à l’obtention d’une solution parfaitement limpide. Le volume correspondant est relevé. Puis, l’addition de l’éthanol est continuée par fraction de 0,1 ml jusqu’à un total de 20 ml, pour observer un trouble ou une opalescence. Le mélange est agité vigoureusement après chaque ajout d’éthanol jusqu’à miscibilité complète.
Méthodes chromatographiques
Plusieurs techniques chromatographiques ont été utilisées pour l’analyse des extraits.
Chromatographie sur Couche Mince (C.C.M.)
La C.C.M. est un procédé de microanalyse utilisant une phase stationnaire poreuse le long de laquelle une phase mobile entraîne à vitesse inégale suivant une direction déterminée, les substances à séparer. La vitesse de migration est fonction de l’affinité des constituants vis à vis de la phase liquide mobile et/ou de la phase fixe adhérant au support chromatographique.
Dans nos manipulations, l’adsorbantemployé est le gel de silice 60F254 d’épaisseur 0,25 mm, fixé sur feuille d’aluminium. L’éluant est versé dans la cuve chromatographique 20 à 30 mn avant le dépôt de la plaque afin d’obtenir la saturation de la cuve.
L’échantillon à analyser est déposé à l’aide d’un tube capillaire sur une ligne tracée à 1 cm du bord de la plaque. 1cm est laissé entre 2 dépôts successifs. L’application est répétée plusieurs fois au même point jusqu’à ce que la quantité déposée soit concentrée, la vérification de la concentration se faisant sous lumière UV. Le dépôt entre chaque application est séché rapidement à l’aide d’un séchoir pour éviter une tache large.
La plaque est ensuite déposée verticalement dans la cuve et on couvre cette dernière pendant le développement. Ce dernier est arrêté lorsque le front du solvant est à 1cm du bord supérieur de la plaque et sa position est marquée.
Après développement, la plaque est séchée puis observée sous la lumière UV aux longueurs d’onde λ=254nm et λ=365nm. Les taches sont cerclées en pointillés au crayon et les couleurs notées.
La révélation se fait à la vanilline sulfurique à l’aide de pulvérisateurs à air comprimé. Elle est suivie d’un séchage de la plaque à 100°C pendant quelques minutes pour la formation des complexes fluorescents en particulier. Les taches sont ensuite cerclées en trait plein.
Chaque tache est représentée par son rapport frontal (Rf) ou référence frontale.
Rf = dx / ds
avec :
dx : distance parcourue par le composé
ds : distance parcourue par le front de l’éluant
Pour un éluant et un support déterminés, le Rf est caractéristique d’une substance donnée.
Chromatographie liquide à basse pression
Selon le mode de remplissage, il existe deux types de colonne : la colonne sèche et la colonne humide.
Le remplissage de nos colonnes a été faite par voie humide. La proportion HE/ adsorbant utilisée est de 1/50 en masse. La phase stationnaire est du gel de silice 60F254.
L’élution est effectuée avec programmation de solvants (gradient d’élution).
L’huile essentielle totale est fractionnée en HY et PO selon la méthode classique de fractionnement. Les éluants utilisés sont :
• L’hexane (100%) : 3 fois Vo pour extraire les produits hydrocarbonés HY,
• L’éther diéthylique (100%) : 3 fois Vo pour recueillir la fraction PO,
• L’éthanol (100%) : 2 fois Vo pour épuiser totalement le dépôt.
Chromatographie en phase gazeuse
La CPG a été effectuée dans les conditions opératoires suivantes :
– Colonne capillaire en silice fondu, Rtx-Wax (30m x 0, 25mm x 0, 25µm) avec une phase stationnaire de polyéthylène glycol.
– Four : 50 oC à 250 oC (6oC/min), pression 0,33 bar
– Température du détecteur (FID) : 260 oC
– Température de l’injecteur : 225 oC
– Gaz vecteur : hydrogène 1,69ml/min
– Volume d’HE injecté : 1 µl
– Surface (% relatifs) : calculée sur colonne
– Solvant utilisé : tertiobutylméthyléther (TBME).
Les constituants ont été identifiés par leurs indices de Kovats respectifs, obtenus par le calcul à partir des temps de rétention relevés sur le chromatogramme obtenu après co-injection de HE totale et la série de paraffines C6 à C15. La formule utilisée pour ce calcul est :
IK = 100 n + 100
tR (X) – tR (n)
tR (n + 1) – tR (n)
n : nombre d’atomes de carbone de la paraffine éluée avant le produit inconnu X
n+1 : nombre d’atomes de carbone de la paraffine éluée après le produit X
tR : temps de rétention
L’indice obtenu est ensuite comparé à une banque de données de composés témoins et avec les données de la littérature.
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAP I: GENERALITES
I. BOTANIQUE DE Helichrysum faradifani
I.1. Classification
I.2. Description botanique
I.3. Répartition géographique
I.4. Ethnobotanique et utilisation
I.5. Travaux antérieurs
CHAP II: MATERIELS ET MÉTHODES
II.1. MATERIELS
1. Matériel végétal
2. Matériels de laboratoire
3. Appareillages d’analyse
4. Produits et réactifs
5. Matériels et produits pour les tests biologiques
II.2. MÉTHODES
1. Extraction de l’huile essentielle
2. Détermination des caractéristiques
2.1.Caractéristiques organoleptiques
2.2. Caractéristiques physiques
a . Mesure de la densité relative à 20°C – NF T 75-111
b. Mesure de l’indice de réfraction (nD ) – NF T 75-112
c. Pouvoir rotatoire ( D ) – NF T 75-113
2.3. Caractéristiques chimiques
a. Indice d’acide (IA) – NF T 75-103
b. Indice d’ester (IE) – NFT 75-104
c. Miscibilité à l’éthanol
3. Méthodes chromatographiques
3.1. Chromatographie sur Couche Mince (C.C.M.)
3.2. Chromatographie liquide à basse pression
3.3. Chromatographie en phase gazeuse
3.4. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse (CPG/SM)
3.5. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (CPG/IRTF)
CHAP III: RESULTATS ET DISCUSSION
III. EXTRACTION, FRACTIONNEMENT ET ANALYSE DE L’HUILE ESSENTIELLE DE Helichrysum faradifani
1. Extractions
1.1. Cinétique de l’extraction
1.2. Résultat des extractions
2. Caractéristiques organoleptiques
2.1. Caractéristiques physico-chimiques
a.Caractéristiques physiques
b.Caractéristiques chimiques
3. Analyses chromatographiques de l’huile essentielle totale de H. faradifani
3.1. Analyse en CCM de l’huile essentielle totale de H. faradifani
3.2. Analyse en CLBP : Fractionnement en HY et PO de HET de H. faradifani
3.3. Analyse en CPG sur colonne moyennement polaire Rt x – Wax
3.4. Analyse en CPG / SM sur colonne apolaire HP5
3.5. Analyse sur CPG/IRTF colonne HP5
3.6. Interprétations des spectres de masse et infra rouge
4. Etude de l’éventuelle activité cicatrisante de l’huile essentielle de Helichrysum faradifani
CHAPIV: CULTURE, PURIFICATION ET PRESERVATION DES CHAMPIGNONS ENDOPHYTIQUES
IV. 1. GENERALITES SUR LES CHAMPIGNONS ENDOPHYTIQUES 81
1.1. Définition
1.2. Classification des champignons endophytiques
1.3. Groupe de champignons endophytiques
1.4.Types de colonisation
1.5. Méthodes de détection
IV.2. CULTURE, PURIFICATION ET PRESERVATION DES CHAMPIGNONS ENDOPHYTIQUES82
2.1. Matériels
2.2. Méthodes
2.3. Résultats
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIQUES
ANNEXE 1
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