L’optimisation de microsystèmes de détection de cellules vivantes à haut débit représente un enjeu important dans différents domaines comme la toxicologie, le criblage de molécules bioactives, l’ingénierie tissulaire ou encore la médecine régénérative. Ces types de biocapteurs peuvent également donner un aperçu de la complexité des interactions cellulescellules ou cellules-surface active, en présence de toxines ou de composés pharmaceutiques par exemple. Cependant, pour des tests à haut débit, la plupart de ces systèmes de détection nécessitent à ce jour des équipements coûteux tels que des incubateurs ou des systèmes d’imagerie optique externe, ainsi que dans la plupart des cas, l’apport de la robotique. De plus, ils se limitent à des méthodes de cultures statiques à l’aide de cellules traditionnelles ayant besoin de réactifs onéreux, de grands volumes, et d’étapes de traitement complexes conduisant à de faibles reproductibilités de dosage et précisions de mesures.
Le principal défi associé à l’adaptation des systèmes traditionnels reste la réduction considérable des volumes d’échantillons et de réactifs, ainsi que la possibilité d’effectuer des analyses en temps réel, voire au chevet du patient. Ainsi, afin de suivre les futures tendances, ces microsystèmes de détection de cellules vivantes ont été récemment associés aux technologies microfluidiques et constituent une nouvelle génération d’outils d’analyses de cellules. Ces dispositifs sont capables de tester à moindre coût des échantillons de faibles populations cellulaires dans des conditions contrôlées et reproductibles, pouvant aller jusqu’à la caractérisation de cellules uniques, révolutionnant ainsi la médecine de précision.
Impédance et analyses cellulaires
Les cellules vivantes possèdent des propriétés biophysiques et biochimiques uniques pour maintenir des fonctions spécifiques dans l’environnement physiologique. Ces propriétés biophysiques (mécaniques et électriques), jouent un rôle important dans la régulation de diverses activités biologiques au niveau moléculaire et cellulaire, et peuvent servir de marqueurs de l’état physiologique des cellules .
La cellule, l’unité fonctionnelle de base des organismes vivants, maintient et détecte l’environnement physiologique de l’organisme à la fois chimiquement et physiquement . Ses propriétés biochimiques et biophysiques uniques lui permettent de remplir des fonctions spécifiques et de s’adapter à son environnement. Les changements physiologiques dans les cellules sont accompagnés de modifications chimiques et physiques ainsi que d’une réorganisation interne. Ainsi, les cellules pathologiques peuvent être identifiées biochimiquement et/ou biophysiquement. Leurs propriétés biochimiques sont étudiées de manière intensive, et de nombreux marqueurs biochimiques ont été développés pour identifier les cellules cibles d’une population hétérogène . Les propriétés biophysiques des cellules jouent également un rôle important dans divers processus biologiques et sont impliquées dans la régulation de l’expression génique, la différenciation, la migration et les activités métaboliques .
Durant les deux dernières décennies, un certain nombre d’outils de recherche ont été développés pour comprendre la relation entre les changements de propriétés biophysiques des cellules et les maladies humaines. L’analyse des propriétés biophysiques, comme la caractérisation électrique, mécanique, optique et thermique des cellules fournit des connaissances essentielles au diagnostic, à la recherche clinique et à l’industrie pharmaceutique. Ces propriétés fournissent également des signaux précoces de maladies, ou tout autre état anormal du corps humain, ce qui en fait des marqueurs potentiels pour l’identification de cancers ou de bactéries, pour la détection de toxines et pour l’étude du statut des tissus.
Les technologies de miniaturisation des dispositifs, telles que la microfluidique, apportent des améliorations significatives dans les secteurs de la biologie et de la recherche clinique . Les analyses de cellules uniques (SCA pou Single Cell Analysis) sont devenues un sujet majeur pour les ingénieurs et les scientifiques au cours des vingt dernières années. Des outils expérimentaux, ainsi que des technologies capables d’effectuer des mesures telles que l’impédance, se sont régulièrement développés afin de proposer un dépistage de cellules uniques, de sous-populations cellulaires ou de microorganismes. Parmi ces outils, la spectroscopie d’impédance électrochimique a gagné en popularité pour de telles applications.
La spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE)
Généralités sur l’impédance
L’impédance est une caractéristique physique d’un système, définie comme le rapport d’une grandeur caractérisant une excitation à laquelle il est soumis à celui d’une grandeur caractérisant sa réponse. Le plus souvent, cette notion s’applique à des grandeurs variables, dont l’évolution peut s’étudier selon les méthodes de l’analyse harmonique. On exprime alors la relation entre l’impédance et la fréquence par l’impédance complexe, une expression mathématique en nombre complexe qui indique à la fois l’amplitude et le déphasage de cette réponse.
L’impédance électrochimique représente la réponse d’un système d’électrodes plongées dans une solution à une excitation électrique. Celui-ci est généralement constitué d’une électrode de travail, d’une contre-électrode et d’une électrode de référence. Dans le cas des milieux biologiques, de fortes perturbations complexes sont produites au niveau de l’interface électrodes/milieu biologique lors de la polarisation de celui-ci . La mesure de l’impédance, souvent difficile à interpréter en raison de la complexité des mécanismes qui interviennent, peut donner de multiples informations sur la nature des ions et espèces présentes en solution ainsi que sur la nature des électrodes, comme l’état de surface ou la porosité.
Principe de la méthode de Spectroscopie d’Impédance Electrochimique
La Spectroscopie d’Impédance Electrochimique (SIE) a connu un essor considérable, en particulier pour l’étude des interfaces électrodes/électrolytes. Cette technique consiste à appliquer une excitation de fréquence variable et à mesurer l’impédance du système pour chacune des valeurs de la fréquence d’excitation. En plus des applications répandues dans les domaines de la caractérisation de matériaux , de batteries , de piles à combustibles ou des phénomènes de corrosion , la SIE a gagné en popularité dans les études de diffusion des ions à travers des membranes ou encore de caractérisation d’interfaces de semi-conducteurs. La mise en œuvre de la SIE peut facilement être automatisée et ses résultats peuvent souvent être corrélés avec des variables ou des processus physico-chimiques tels que : transport de masse, vitesse de réaction, corrosion, propriétés diélectriques, défauts, microstructure, influence de la composition, mobilité et concentration des espèces mobiles.
La SIE s’est développée ces dernières années pour la caractérisation d’électrodes fonctionnalisées dans le domaine de la biologie (immobilisation de biomatériaux, enzymes, anticorps, cellules, … modifiant la capacitance et le transfert d’électrons au voisinage de la surface active) ou l’étude des transformations biocatalytiques au niveau des surfaces d’électrodes (analyse des changements d’interfaces, de cinétique et des mécanismes de transfert d’électrons), et en particulier pour la transduction des événements de biodétection. Les mesures par SIE ont ainsi permis de caractériser les propriétés impédimétriques de tissus biologiques, la composition générale d’échantillons biologiques ou la différenciation cellulaire. Différents immunocapteurs utilisant les mesures d’impédance ont ainsi été développés pour traduire les interactions antigène-anticorps, d’ADN ou d’enzymes.
La SIE repose sur la mesure d’une fonction de transfert suite à la perturbation volontaire du système électrochimique étudié. Le système réagit en émettant un signal y(t) quand il est soumis à une perturbation x(t) . Les deux signaux x(t) et y(t) sont alors reliés par une fonction de transfert H(ω) telle que :
?(?) = ?(?) ?(?)
X(ω) et Y (ω) étant respectivement les transformées de Fourier de x(t) et y(t).
La perturbation imposée pour la mesure de l’impédance électrochimique est sinusoïdale. Le signal appliqué est donc de la forme :
?(?) = ? sin(??)
Et la réponse du système étant :
?(?) = ? sin(?? + ?)
avec une fréquence f, une pulsation ω = 2πf, et un déphasage φ.
L’analyse de la réponse du système contient des informations sur l’interface électrode/électrolyte, la structure des électrodes et les réactions qui se déroulent au voisinage de la surface d’électrodes.
En mode potentiostatique, la consigne est définie par :
?(?) = ?0 + ? sin(??)
Et la mesure représente un courant défini par :
?(?) = ?0 + ? sin(?? + ?)
Effets d’interfaces électrode/électrolyte
Chute ohmique
Dans une cellule électrochimique, l’électrode de référence et la contre-électrode étant placées relativement loin de la surface de l’électrode de travail, la polarisation de l’électrode de travail induit une chute ohmique égale au produit du courant induit et de la résistance d’électrolyte Re . L’impédance de la chute ohmique est donc donnée par :
??? (?) = ??
Pour une électrode classique du type disque, cette résistance varie en 1/r, r étant le rayon du disque de l’électrode. Il y a donc un réel intérêt à diminuer la taille des électrodes .
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Table des matières
Introduction générale
Chapitre 1 : Impédance et analyses cellulaires
1. Introduction
2. La spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE)
2.1. Généralités sur l’impédance
2.2. Principe de la méthode de Spectroscopie d’Impédance Electrochimique
2.3. Effets d’interfaces électrode/électrolyte
2.3.1. Chute ohmique
2.3.2. La capacité de double couche
2.3.3. Processus Faradique
2.3.4. Diffusion des espèces à l’électrode
2.4. Exploitation des résultats : schémas électriques équivalents
2.5. Représentation en SIE
2.5.1. Diagramme de Bode
2.5.2. Diagramme de Nyquist
3. Applications de l’impédance à l’analyse des cellules
3.1. Analyses collectives
3.1.1. Différenciation cellulaire
3.1.2. Mesure d’adhérence
3.1.3. Cytotoxicité et criblage de substances bioactives
3.2. Analyse individuelle
3.2.1. Comptage individuel type Coulter
3.2.2. Analyse de la cellule unique
3.3. Microscopie par mesure d’impédance électrochimique
3.4. Un dispositif impédimétrique commercial, le capteur multiparamétrique, Bionas 2500®
4. Systèmes impédimétriques microfluidiques
4.1. Choix des matériaux
4.2. Caractéristiques de l’écoulement
4.3. Exemples de réalisation de dispositifs microfluidiques impédimétriques
5. Conclusion
Bibliographie
Chapitre 2 : Descriptif du projet
1. Introduction
2. Présentation générale du laboratoire sur puce
2.1. Principe général
2.2. Choix des cellules
2.3. Description du dispositif développé
2.3.1. Phase de marquage
2.3.2. Phase de séparation magnétique
2.3.3. Phase de détection
3. Objectifs de la thèse
3.1. Influence de la taille des microélectrodes
3.2. Bio fonctionnalisation des microélectrodes
3.3. Matériels et Méthodes d’analyses
4. Conclusion
Bibliographie
Chapitre 3 : Etudes de la sensibilité des microélectrodes
1. Introduction
2. Première génération de dispositif
2.1. Technologie de microfabrication
2.1.1. Préparation du substrat
2.1.2. Photolithographie et structuration des électrodes d’or
2.1.3. Métallisation
2.1.4. Réalisation des canalisations en PDMS
2.2. Qualification en mode statique
2.3. Qualification en mode fluidique
3. Seconde génération de dispositif
3.1. Technologie de microfabrication
3.2. Qualification en mode statique
3.2.1. Tests de spécificité
3.2.2. Fonctionnalisation et piégeage cellulaire
3.3. Qualification en mode fluidique
3.3.1. Modifications technologiques de microfabrication
3.3.2. Tests de fonctionnalisation de la SU8
3.3.3. Fonctionnalisation des microélectrodes
3.3.4. Piégeage cellulaire
4. Optimisation du design des microélectrodes Interdigitées
4.1. Variation de l’espace inter-électrode
4.2. Influence du nombre de brins
4.2.1. Modifications technologiques
4.2.2. Piégeage cellulaire
5. Conclusion
Conclusion générale
