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Principales caractéristiques de la fluorescence
Spectres d’absorption et d’émission
Chaque fluorophore est caractérisé par un spectre d’absorption et un spectre d’émission qui lui est propre et qui correspond à la distribution de probabilités des transitions d’énergies. Cela permet d’expliquer que le spectre d’absorption est composé de larges bandes correspondant à de nombreuses bandes d’absorption des différentes transitions vibrationnelles.4
Le spectre de fluorescence représente l’intensité recueillie par le détecteur en fonction de l’énergie émise par l’échantillon. Il est situé à des longueurs d’onde plus grandes (c’est-à-dire à des énergies plus basses) que le spectre d’absorption à cause de la perte d’énergie due à la relaxation vibrationnelle dans l’état excité.
Déplacement de Stokes
Le déplacement de Stokes Δλ correspond à l’écart entre les maxima du spectre d’émission et du spectre d’absorption (Figure 1.6). D’un point de vue pratique, la détection de la fluorescence sera plus facile si le déplacement de Stokes est grand (> 20 nm).
Rendement quantique de fluorescence
Le rendement quantique de fluorescence décrit la probabilité de fluorescence de la molécule étudiée. Il correspond au nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés (1.1), et donc plus le rendement est grand plus la molécule est fluorescente. ΦF = Némis (1.1)
D’un point de vue pratique, le rendement quantique est calculé par rapport à un étalon dont le rendement quantique est connu, suivant l’équation 1.2 : ΦF = ΦF(ét) AF(ét)n(ét)A(ét) F » n # 2 (1.2) avec ΦF le rendement quantique de fluorescence, A l’absorbance à la longueur d’onde d’excitation, F l’aire sous la courbe d’émission et N l’indice de réfraction du solvant utilisé. L’indice éT correspond à l’étalon utilisé pour le calcul.
Il est préférable, au vu de l’équation 1.2, de choisir un étalon dont la longueur d’onde d’excitation est identique à celle du fluorophore étudié mais aussi dont le spectre d’émission couvre une zone comparable. Par soucis de précision, nos échantillons seront analysés sur une gamme de quatre à cinq concentrations dont l’absorbance sera < 0.1 d’unité d’absorbance afin d’éviter les phénomènes de réabsorption.5 La linéarité de l’absorbance en fonction de l’aire sous la courbe d’émission devra être vérifiée. Les coefficients directeurs des droites sont alors proportionnels aux rendements quantiques de fluorescence. Il faut noter que la précision dans la détermination d’un rendement quantique peut difficilement dépasser les 90-95% en raison de l’accumulation d’erreurs inévitables lors de la détermination des absorbances à la longueur d’onde d’excitation, des facteurs de correction des spectres et du rendement quantique de l’étalon.
Coefficient d’extinction molaire
Le coefficient d’extinction molaire ε, intensité d’absorption ou absorbance spécifique, traduit l’efficacité avec laquelle un fluorophore absorbe dans un solvant donné. Il provient de la loi de Beer-Lambert (1.3) : A = ε l c (1.3)
Facteurs environnementaux influençant la fluorescence
Les propriétés de fluorescence précédemment citées : rendement quantique de fluorescence, coefficient d’extinction molaire, intensité de fluorescence et durée de vie de fluorescence ne correspondent à la signature d’une molécule que sous certaines conditions. En effet, l’influence de facteurs propres à l’environnement de la molécule peuvent entraîner des changements importants. Ces facteurs sont variés et nous traiterons seulement de la température, la polarité, le pH, le photoblanchiment et le quenching.
La température
Les changements de température entraînent des variations de viscosité du solvant, et donc des variations du nombre de collisions des molécules fluorescentes avec le solvant, de rotations intramoléculaires et de vibrations. L’intensité de fluorescence et le rendement quantique sont sensibles à de tels changements. Afin de contrôler ce facteur, l’utilisation de cellules thermostatées est alors recommandée.
La polarité
La polarité influence de manière importante les propriétés de fluorescence. Les composés sont dit solvatochromiques lorsque la position des spectres d’absorption et d’émission d’une molécule dépendent de la polarité du solvant. Des déplacements vers les grandes longueurs d’onde (bathochrome) et vers les courtes longueurs d’onde (hypsochrome) lorsque la polarité varie sont appelés respectivement solvatochromisme positif et négatif.
Pour absorber un photon, la molécule doit passer à un état excité, or la disponibilité d’un électron π, ou d’un électron délocalisé d’un noyau aromatique est dépendant de son environnement. De plus, la polarité modifie la stabilité des formes moléculaires. Le fluorophore se retrouve alors plus polaire à l’état excité qu’à l’état fondamental provoquant une fluorescence à des longueurs d’onde d’autant plus grandes que l’état excité est alors plus stable.
Pour absorber un photon, la molécule doit passer à un état excité, or la disponibilité d’un électron π, ou d’un électron délocalisé d’un noyau aromatique est dépendant de son environnement. De plus, la polarité modifie la stabilité des formes moléculaires. Le fluorophore se retrouve alors plus polaire à l’état excité qu’à l’état fondamental provoquant une fluorescence à des longueurs d’onde d’autant plus grandes que l’état excité est alors plus stable.
Le pH
Les propriétés acido-basiques d’une molécule ne sont pas les mêmes à l’état fondamental S0 qu’à l’état excité Sn provoquant ainsi des modifications dans les spectres d’absorption et de fluorescence. La redistribution de la densité électronique au cours de l’excitation est l’une des causes possibles.
Un cas particulièrement intéressant est celui où l’acide (ou la base) est plus fort à l’état excité qu’à l’état fondamental, puisque dans ce cas, l’excitation peut déclencher un transfert de proton. Le caractère acide du groupe donneur de proton (par exemple –OH sur un noyau aromatique) peut être exalté lors de l’excitation de sorte que le pKa de ce groupe à l’état excité est beaucoup plus petit que le pKa à l’état fondamental. Au contraire, le pKa d’un groupe accepteur de proton (par exemple un atome d’azote hétérocyclique) à l’état excité est plus élevé que le pKa de l’état fondamental.
Un cas particulièrement intéressant est celui où l’acide (ou la base) est plus fort à l’état excité qu’à l’état fondamental, puisque dans ce cas, l’excitation peut déclencher un transfert de proton. Le caractère acide du groupe donneur de proton (par exemple –OH sur un noyau aromatique) peut être exalté lors de l’excitation de sorte que le pKa de ce groupe à l’état excité est beaucoup plus petit que le pKa à l’état fondamental. Au contraire, le pKa d’un groupe accepteur de proton (par exemple un atome d’azote hétérocyclique) à l’état excité est plus élevé que le pKa de l’état fondamental.
Le photoblanchiment
Le « photobleaching » (photoblanchiment) correspond à une perte progressive de l’intensité de fluorescence d’une molécule résultant d’une interaction entre l’excitation lumineuse et le fluorophore.
La perte de fluorescence est souvent due à la « photo-oxydation », qui correspond à l’oxydation du fluorophore en présence de lumière. C’est un processus irréversible : la molécule photoblanchie peut avoir subi une modification structurale donnant lieu à une nouvelle molécule fluorescente ou non, ayant des propriétés photophysiques différentes.
Le phénomène de photoblanchiment dépend de la longueur d’onde et de la puissance de l’excitation lumineuse mais aussi de la structure du fluorophore et de son environnement. Un exemple de photoblanchiment est présenté dans la figure suivante où l’on constate la diminution de la fluorescence sur une cellule fibroblaste. Après une longue exposition, la fluorescence du noyau a disparu et la fluorescence verte diminue. La fluorescence rouge reste quant à elle, inchangée (Figure 1.8).
La perte de fluorescence est souvent due à la « photo-oxydation », qui correspond à l’oxydation du fluorophore en présence de lumière. C’est un processus irréversible : la molécule photoblanchie peut avoir subi une modification structurale donnant lieu à une nouvelle molécule fluorescente ou non, ayant des propriétés photophysiques différentes.
Le phénomène de photoblanchiment dépend de la longueur d’onde et de la puissance de l’excitation lumineuse mais aussi de la structure du fluorophore et de son environnement. Un exemple de photoblanchiment est présenté dans la figure suivante où l’on constate la diminution de la fluorescence sur une cellule fibroblaste. Après une longue exposition, la fluorescence du noyau a disparu et la fluorescence verte diminue. La fluorescence rouge reste quant à elle, inchangée (Figure 1.8).
Petites molécules organiques fluorescentes
Les petites molécules organiques fluorescentes ont beaucoup été étudiées pour différentes applications dans les matériaux et les sciences biomédicales. De plus, de nombreuses études ont été effectuées dans le but de découvrir de nouveaux fluorophores mais aussi dans le but d’améliorer leurs propriétés photophysiques telles que le rendement quantique, le déplacement de Stokes, les longueurs d’onde d’absorption et d’émission… Malgré un grand nombre de fluorophores différents, il n’existe qu’un nombre limité de squelette possédant suffisamment de flexibilité pour permettre ces améliorations via différentes voies de synthèse.
Un exemple connu de fluorophore organique concerne les cyanines dont les propriétés photophysiques sont fortement modifiées en fonction de leur structures (Figure 1.26).32,33
On constate ainsi que l’extension de la conjugaison par ajout d’une double liaison sur la chaîne entraîne un effet bathochrome de 100 nm. De même, l’orthocondensation sur les cycles benzéniques permet l’obtention d’un effet bathochrome de 20-40 nm. Ces variations de longueur d’onde d’émission basées sur la compréhension des relations structure-propriétés photophysiques des cyanines ont alors permis de développer des fluorophores émettant dans le proche infrarouge.34,35
Absorption à deux photons
L’optoélectronique définit ce qui est relatif à la technique permettant la transformation des signaux électriques en signaux optiques et inversement.72 Cette technique touche de nombreux secteurs d’activité aussi bien grand public (camescopes, écrans plats à cristaux liquides, lecteurs de CD et de vidéos…) que des secteurs plus spécialisés (imprimantes lasers, capteurs à fibres otiques, liaisons inter satellites…). Plusieurs facteurs ont rendu possible ces réalisations : la maîtrise et l’élaboration des matériaux semi-conducteurs ainsi que la mise au point de diodes laser ; le développement des fibres optiques de haute pureté permettant la transmission des signaux sur plusieurs centaines de kilomètres ; et la découverte des lasers femtosecondes (1 fs = 10−15 s) qui sont des sources brèves et très intenses permettant de créer des champs électromagnétiques importants. C’est d’ailleurs grâce à l’arrivée des lasers, que le phénomène d’absorption à deux photons a pu être démontrée expérimentalement.
Principe de l’absorption à deux photons
L’absorption à deux photons est un procédé d’optique non-linéaire du troisième ordre qui a été prédit en 1931 par Maria Göppert-Mayer (co-lauréate avec Hans Daniel Jensen du prix Nobel de Physique en 1963, « pour leurs découvertes à propos de la structure en couches du noyau atomique ») au cours de son doctorat à l’université de Göttingen.73 Elle explique que des photons de plus faible énergie peuvent, ensemble, entraîner une excitation « normalement » obtenue par l’absorption d’un seul photon d’énergie plus élevé.74,75 Cependant, la probabilité d’absorption à deux photons obtenue est trop petite pour être mesurée avec la lumière « conventionnelle ». C’est pour cette raison, qu’il a fallu attendre l’arrivée des lasers dans les années 1960 pour observer réellement le phénomène d’ADP. En 1961, un an seulement après l’arrivée du premier laser,76 Kaiser et Garrett rapportent la première observation de l’absorption à deux photons dans un échantillon de CaF2:Eu2+ cristallin sous la radiation intense d’un laser pulsé aux cristaux de rubis à 694,3 nm.
L’absorption à deux photons est effectuée à une longueur d’onde d’excitation plus grande afin d’éviter l’absorption plus forte d’un seul photon de telle sorte que deux photons soient nécessaires pour atteindre le même niveau d’énergie (Figure 1.44). L’absorption des deux photons se fait de façon simultané et non de façon séquentielle d’où l’absence d’état intermédiaire. L’émission du fluorophore s’effectue à partir du même état excité que pour l’absorption à un photon.
L’atténuation du faisceau lumineux passant à travers un milieu s’exprime généralement ainsi : dI (Z) = −αI (Z) − βI 2(Z) − γI 3(Z) − ηI 4(Z) (1.5)
avec I (Z) l’intensité du faisceau lumineux incident le long de l’axe Z et α, β, γ et η les coefficients d’absorption à 1, 2, 3, 4 photons du milieu. Si l’on considère le rayon incident comme étant uniforme, que l’intensité initiale ne dépend pas du temps et qu’il n’y a pas d’absorption linéaire (α = 0) à la longueur d’onde λ, alors pour l’absorption à deux photons, l’équation précédente devient : dI (Z) = −βI 2(Z) (1.6)
Cela signifie que la probabilité d’absorption à deux photons d’une molécule donnée est proportionnelle au carré de l’intensité lumineuse. La solution de l’équation 1.6 est donc : I(Z, λ) = I0(λ) (1.7) avec I0 (λ) l’intensité du rayon incident, Z la longueur de propagation dans le milieu étudié et β(λ) le coefficient d’ADP qui dépend de la longueur d’onde du rayon incident.
En tant que paramètre macroscopique, et donc dépendant de la concentration des molécules absorbantes à deux photons, β(λ) peut aussi s’exprimer ainsi : β(λ) = σ′(λ) N0= σ′(λ) NA DO × 10−3(1.8)
où σ′ est la section efficace, N0 la densité moléculaire, NA le nombre d’Avogadro et D0 la concentration des molécules absorbantes. La section efficace s’exprime en cm4.s.photons-1.molécule-1, et pour simplifier l’écriture, elle est le plus souvent exprimée en GM (Göppert-Mayer) avec 1 GM ≡ 10-50 cm4.s.photons-1.molécule-1.75
La dépendance au carré est la base même de la nature de l’absorption à deux photons puisque doubler l’intensité lumineuse entraîne une augmentation de la fluorescence par quatre. Focaliser le faisceau réduit donc sa taille mais augmente son intensité, ce qui se traduit par une quantité lumineuse non constante à travers la cuve et un maximum d’intensité au point focal du laser (à droite sur la Figure 1.45). C’est donc au point focal que s’effectue l’absorption à deux photons.
Détermination du squelette
Synthèse du lien π–conjugué
La première étape a consisté en la fonctionnalisation du fluorène. Pour cela, nous avons dans un premiers temps introduit deux halogènes différents en position 2 et 7 du fluorène afin de pouvoir réaliser les différents couplages de façon régiosélective.
Tout d’abord, une monobromation a été réalisée sur le fluorène en présence d’un équivalent de N-bromosuccinimide et de carbonate de propylène. L’intermédiaire monobromé 1 est obtenu majoritairement avec un rendement de 79% après recristallisation. Ensuite, une substitution électrophile aromatique est effectuée en présence d’iode en position 7 afin d’obtenir le 2-bromo-7-iodofluorène 2 avec un rendement de 74% après purification par recristallisation (Schéma 2.3).
La dernière étape permet l’introduction de chaînes alkyles permettant une meilleure solubilité en solvant organique usuel. Pour cela, 2 conditions ont été étudiées au cours de ce travail. La première consiste en une alkylation par transfert de phase en présence de NaOHaq. Bien que la présence de chlorure de tetrabutylammonium comme agent de transfert ne soit pas nécessaire, elle permet de réaliser la réaction sous agitation modérée. Le produit 3 est alors obtenu avec un rendement de 63%.158
La seconde condition consiste à utiliser une base forte dans le THF en suivant la méthode décrite par Bazan.159 Une augmentation du rendement de 63 à 93 % est alors observée pour conduire au composé 3 (Schéma 2.4).
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Table des matières
Liste des schémas
I Introduction générale
1 Introduction
1.1 Fluorescence
1.1.1 Description de la luminescence
1.1.2 Principe de la fluorescence
1.1.3 Principales caractéristiques de la fluorescence
1.1.4 Facteurs environnementaux influençant la fluorescence
1.1.5 Facteurs moléculaires influençant la fluorescence
1.2 Grandes familles de fluorophores
1.2.1 Fluorophores naturels
1.2.2 Fluorophores synthétiques
1.3 Absorption à deux photons
1.3.1 Principe de l’absorption à deux photons
1.3.2 Fluorophores
1.3.3 Applications
1.4 Tomographie par émission de positons
11.5 Sondes multimodales
1.5.1 Introduction générale
1.5.2 Sonde bimodale TEP/fluorescence dans le proche infrarouge
1.6 Présentation du projet
II Résultats et discussion
2 Version chaînes alkyles
2.1 Fluorène et absorption à deux photons – rappel bibliographique
2.2 Détermination du squelette
2.2.1 Synthèse du lien π–conjugué
2.2.2 Synthèse des composés de type I
2.2.3 Synthèse des composés de type II
2.2.4 Synthèse des composés de type III
2.2.5 Synthèse des composés de type IV
2.3 Propriétés photophysiques
2.3.1 Propriétés d’absorption à un photon et de fluorescence
2.3.2 Propriétés d’absorption à deux photons
2.4 Conclusion
3 Version hydrosoluble
3.1 Fluorène hydrosoluble – rappel bibliographique
3.2 Détermination du squelette
3.2.1 Synthèse du lien π–conjugué
3.2.2 Synthèse des composés de type I
3.2.3 Synthèse des composés de type II
3.3 Propriétés photophysiques
3.3.1 Propriétés d’absorption à un photon et de fluorescence
3.3.2 Propriétés d’absorption à deux photons
3.3.3 Test bi-photonique
3.4 Conclusion
4 Insertion du fluor
4.1 Via une diazine
24.2 Via un triazole
4.2.1 Version phénol
4.2.2 Version o-silylée
4.2.3 Version méthoxy
4.2.4 Insertion du –BF2 en version phénol
4.2.5 Version amine
4.2.6 Insertion du –BF2 en version amine
4.3 Conclusion
III Conclusion générale et perspectives
5 Conclusion générale et perspectives
5.1 Conclusion
5.2 Perspectives
IV Experimental part
6 General remarks
7 Compounds with alkyl chains
8 Compounds with hydrosoluble chains
9 Compounds from the BODIPY study
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