Nouvelles maladies infectieuses et propagation rapide

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Lutte contre les maladies infectieuses : grandeur et décadence des thérapies

Si les maladies infectieuses ont eu un impact majeur sur l’évolution de la population mondiale dans les siècles passés (en décimant parfois des populations entières sur des périodes très courtes comme pour les grandes épidémies de peste), la médecine de la fin du XIXème siècle a fait émerger des stratégies de lutte extrêmement efficaces qui ont réduit cet impact de façon considérable, au point que certaines infections ont quasiment complètement disparu. Cependant, non seulement cette éradication n’est pas totale, mais les moyens de lutte s’épuisent face à une évolution accélérée des agents pathogènes et de leurs modes de propagation.

Nouvelles maladies infectieuses et propagation rapide

L’émergence et la propagation de nouvelles maladies infectieuses, telles que la dengue, le VIH, la famille des coronavirus ou encore la grippe aviaire sont plus que jamais préoccupantes pour l’avenir de la population.

De plus en plus de facteurs favorisent l’apparition et la diffusion de ces maladies. La promiscuité entre les habitats des hommes et des animaux, dont les territoires sont modifiés par les déforestations massives et la croissance démographique, favorise la transmission de maladies entre l’animal et l’homme (on parle de zoonose). La grippe aviaire en est un exemple récent.

Le tourisme et l’explosion du trafic aérien, ainsi les changements climatiques modifient la dynamique de propagation des infections, et rendent plus difficile le confinement d’un pathogène à un territoire donné. La dengue est un exemple frappant de cette nouvelle dissémination (figure 1.6) : le nombre de cas déclarés a explosé en 50 ans, passant de moins de 20 000 cas dans les années 1960 à près d’un million de personnes contaminées dans les années 2000. Les pays touchés par cette maladie sont pratiquement 10 fois plus nombreux qu’il y a 50 ans.

Impact des maladies infectieuses

Emergence de pathogènes résistants

Le nombre de décès à cause des maladies infectieuses a considérablement diminué pendant le siècle dernier, notamment grâce à l’utilisation des antibiotiques. Cependant l’utilisation massive des antibiotiques est au cœur des préoccupations des instances de santé, car cet usage favorise l’émergence de pathogènes résistants [de Sande-Bruinsma et al., 2008]. C’est une course de vitesse permanente entre l’adaptabilité sans commune mesure des micro-organismes et la découverte de nouveaux moyens pour lutter contre ces pathogènes.

En effet, les pathogènes s’adaptent de plus en plus vite aux nouveaux antibiotiques (figure 1.7). Cou-plée au temps de génération très court des agents, la pression de sélection imposée par l’utilisation massive d’antibiotiques favorise à la fois la sélection des souches pathogènes les plus résistantes et l’émergence de nouveaux mécanismes de résistance. En outre, les agents bactériens peuvent transmettre l’acquisition de nouveaux mécanismes de résistance entre différentes espèces par conju-gaison, un mécanisme de transfert qui leur permet d’échanger des plasmides porteurs de gènes de résistance [Cohen et al., 1972]. Ce mécanisme accélère la diffusion des mécanismes de résistances entre les espèces. La situation est d’autant plus préoccupante que le nombre de nouvelles molécules antibiotiques mises sur le marché diminue chaque année (figure 1.8).

L’émergence de ces nouveaux pathogènes résistants (comme certaines souches résistantes à la méticilline dans l’espèce Staphylococcus aureus) est donc un véritable problème de santé publique, mais devient aussi un problème économique, puisque les soins associés à ces pathogènes nécessitent généralement une hospitalisation plus longue et des médicaments plus coûteux. Le surcoût associé aux infections de pathogènes résistants était estimé à 5 milliards de dollars pour les Etats-Unis en 2004 [IDSA, 2004], et à plus d’un milliard d’euros pour l’Europe en 2007 [ECDPC, 2009].

Le problème de l’émergence de mécanismes de résistance chez les pathogènes n’est malheureu-sement pas réduit au monde bactérien. Les virus peuvent aussi s’adapter : le VIH est maintenant capable de devenir résistant aux molécules thérapeutiques, comme l’azidothymidine (AZT), l’un des constituant des trithérapies [Tu et al., 2010]. Le paludisme est lui aussi concerné par l’émergence de résistance : un des parasites à l’origine de la maladie, Plasmodium falciparum, est devenu résistant aux précédentes générations de médicaments comme la chloroquine.

Découverte de pathogènes oncogènes

La communauté scientifique s’intéresse aussi à nouveau aux maladies infectieuses à cause de l’exis-tence d’une relation entre virus ou bactéries et cancers [Huebner and Todaro, 1969]. La mise en évidence d’un lien entre l’apparition d’un cancer et les papillomavirus [Bosch et al., 2002] a permis de mettre au point un nouveau vaccin dont le but est de réduire le nombre de cancers du col de l’utérus. Les scientifiques portent donc une attention toute particulière à ces maladies infectieuses qui peuvent avoir de fortes répercutions en oncologie.

L’infection chronique de l’estomac par la bactérie Helicobacter pilori est également connue pour être une cause majeure de cancer de l’estomac [Blaser et al., 1995]. Des méthodes de détection de cette bactérie ont été mises en place pour caractériser les cas d’infections dès que l’infection devient symptomatique, avec un impact certain sur l’efficacité et la pertinence des traitements et l’occurrence des cancers. L’un des enjeux actuels est d’amener ces tests à un niveau de simplicité et de coûts suffisant pour mettre en place des campagnes de dépistage sur les patients asymptomatiques.

Focus sur les infections du sang

Avant-propos

Le sang (figure 1.9) est habituellement un milieu stérile, dans lequel on retrouve des populations cellulaires ayant de grandes disparités en taille et en concentration (tableau 1.3). On compte en général un globule blanc (GB) pour 650 globules rouges (GR), et une plaquette pour 20 globules rouges.

Il arrive régulièrement que le sang circulant soit contaminé par des bactéries (par exemple à la suite d’une blessure, mais également à cause d’une certaine perméabilité des parois de l’intestin dans certaines conditions). Chez des personnes en bonne santé, de tels évènements sont parfaitement maîtrisés par le système immunitaire et restent asymptomatiques. Lorsque ce n’est pas le cas (patients immunodéprimés par exemple) et que les bactéries se retrouvent en quantité importante dans le sang,

Objectifs du diagnostic des maladies infectieuses

Intérêt des tests de diagnostic IN VITRO

Afin de soigner au mieux les patients victimes de maladies infectieuses, les tests de diagnostic in vitro visent à détecter la présence d’un pathogène à partir d’un échantillon et à l’identifier.
Détection précoce pour éviter la propagation De façon générale, la première fonction du diag-nostic in vitro est de pouvoir détecter au plus vite la maladie, pour empêcher sa transmission et sa propagation en prenant des mesures sanitaires adaptées. Cet aspect est essentiel en particulier pour les maladies transitoirement asymptomatiques, comme le VIH ou la syphilis. Dans ce cas, la détection des porteurs contagieux permet de limiter la transmission de la maladie.
Identification pour un traitement adapté La seconde fonction du diagnostic est de guider le choix de la thérapie par un médecin. Pour cela, les méthodes de diagnostic doivent parvenir à identifier au plus vite le pathogène à l’origine de la maladie et guider le choix du ou des antibiotiques à administrer. Ces aspects sont particulièrement cruciaux pour des maladies dont les symptômes ne sont pas spécifiques, comme les fortes fièvres par exemple.
Utilisation raisonnée des antibiotiques A l’heure où le phénomène de résistance aux antibiotiques s’accélère et que le développement de nouveaux agents anti-infectieux diminue, il devient primordial d’utiliser les antibiotiques de manière judicieuse et à bon escient. Connaître l’identité d’un pathogène à l’origine d’une maladie permet de maîtriser l’usage des antibiotiques. En particulier, cela permet d’éviter l’utilisation inutile d’antibiotique pour une infection virale (dans le cas d’une angine par exemple), mais aussi de réduire l’utilisation prolongée d’antibiotiques à large spectre en utilisant des antibiotiques plus ciblés selon le type du pathogène identifié.

Septicémie : cahier des charges des tests de détection

Dans le cas de la septicémie, le choix de la thérapie a une importance vitale. Comme les signes cliniques ne sont pas spécifiques, il est d’autant plus important, pour cibler au mieux le traitement, de déterminer la nature et les caractéristiques de l’agent pathogène. Il s’agit, le plus rapidement possible, de confirmer la présence d’un pathogène, de permettre son identification, et déterminer son profil de sensibilité aux antibiotiques.
20 à 30% des patients ne reçoivent toujours pas une thérapie antibiotique adaptée contre l’agent infectieux [Harbarth et al., 2003] [Leibovici et al., 1998], ce qui diminue leur chance de survie : l’amélioration des tests de diagnosctics in vitro est donc primordiale. En outre, un meilleur diagnostic permettrait de réduire le coût de la prise en charge hospitalière d’une septicémie (estimé à 22 100 $ par cas en 2001 aux Etats-Unis [Angus et al., 2001]), en réduisant le temps d’hospitalisation, et à plus long terme en limitant l’émergence de pathogènes résistants.
Pour qu’un test soit efficace pour le diagnostic d’une septicémie, il doit répondre à trois critères essentiels : il doit être rapide, sensible, et générique.
Rapidité La rapidité d’administration d’une antibiothérapie est un facteur crucial pour les chances de survie du patient. En pratique, l’état du patient s’altère à une rapidité telle que le médecin n’est pas prêt à attendre les résultats d’un quelconque test. L’antibiothérapie est donc administrée immédiatement. Le résultat des tests de détection/identification/résistance aux antibiotiques peut servir à réorienter la thérapie en restreignant le spectre des antibiotiques utilisés et en adaptant les doses administrées. En pratique, si l’on considère la méthode classique de diagnostic basée sur la croissance bactérienne (détaillée dans le prochain chapitre), le résultat du test arrive au mieux au bout de quelques jours et est rarement utilisé pour réorienter une quelconque décision thérapeutique sur le patient concerné. En revanche, fournir les informations de diagnostic plus tôt, et en particulier au moment où les cliniciens souhaitent orienter ou réorienter leur décision, apporterait une valeur médicale très importante à ce type de tests.
Sensibilité Une grande difficulté du diagnostic des infections du sang vient de la très faible quantité de pathogènes dans le sang : la concentration des micro-organismes est généralement inférieure à 10 ufc 8 /mL, et n’excède pas 1 ufc/mL chez 50% des patients adultes [Lamy, 2005]. Le test doit permettre de détecter la présence d’un pathogène parmi plus de cinq milliards de globules rouges. Quelle que soit la méthode de détection du pathogène, elle doit donc être extrêmement sensible. Généricité De très nombreuses familles de micro-organismes peuvent être à l’origine des infections du sang. Il faut donc que le test soit capable de détecter indifféremment la présence de levures, de bactéries Gram- et de bactéries Gram+.

Coloration de Gram et examen microscopique

Après l’obtention d’une hémoculture positive, la première analyse à être effectuée est la colora-tion de Gram, qui permet de visualiser l’absence ou non de membrane externe, et donc de distin-guer les bactéries Gram+ des bactéries Gram-. Cette étape permet aussi d’observer la forme des micro-organismes (coques, bacilles,. . . ), ainsi que leur agencement (micro-organismes en grappe, en chaînette ou isolés).

Les résultats de la coloration de Gram et des premières observations microscopiques constituent un premier outil pour l’identification du pathogène, et permettent d’affiner le diagnostic de façon probabiliste. Par exemple une bactérie Gram+ en grappe appartient généralement à la famille des staphylocoques : cette première information peut donc confirmer ou réorienter le traitement anti-biotique. Ces résultats ne sont pas suffisants pour autant, puisqu’ils ne permettent pas de connaître l’identité précise du pathogène, et les antibiotiques administrés doivent donc toujours couvrir une large gamme de pathogènes (la famille des staphylocoques comprend par exemple les espèces S. aureus et S. epidermidis, dont le traitement pourrait être différent).

Il faut donc ensuite isoler le pathogène afin de l’identifier formellement et de déterminer sa sensibilité aux antibiotiques.

Isolement

Une fraction de l’échantillon est donc étalée sur une boîte de milieu de culture gélosé pour obtenir, après culture, des colonies isolées. Cette étape d’isolement repose à nouveau sur la croissance des pathogènes : elle dure en général 18 à 24h pour E. coli, dont le temps de génération est court, mais peut s’étendre sur 3 semaines pour les mycobacteries.

Certains milieux de culture gélosés peuvent contenir des substrats chromogènes qui permettent de révéler une activité enzymatique particulière et donner un premier niveau d’identification. Le milieu de culture peut également favoriser la croissance de certains micro-organismes, voire contenir des antibiotiques. La croissance de colonies renseigne alors sur l’identité et la présence d’un mécanisme de résistance à l’antibiotique considéré. A titre d’exemple, il existe des milieux qui permettent de détecter spécifiquement les staphylocoques dorés résistants à la méticilline (figure 2.4). En effet, la distinction rapide entre les staphylocoques dorés sensibles ou résistants à la méticilline est d’une importance capitale dans le choix de l’antibiothérapie.

Identification phénotypique

L’identification complète du pathogène se fait en réalisant une série de tests biochimiques, comme le besoin en oxygène, ou la capacité à dégrader certains composés chimiques. Ce test se présente généralement sous forme de galeries comportant plusieurs puits, où chaque puits permet d’interroger un aspect particulier du métabolisme du micro-organisme. En regroupant les réponses de chacun des puits, il est alors possible d’identifier très précisément le pathogène. La figure 2.5 illustre quelques-unes des galeries commercialisées. Les résultats sont obtenus à partir d’une colonie isolée, en général après 18 à 24h.

Ce système de test en combinatoire a été automatisé dans le système Vitek2 de bioMérieux, qui est aujourd’hui la référence dans les laboratoires de microbiologie clinique.

Antibiogramme

Des tests de sensibilité aux antibiotiques sont lancés en parallèle, en déposant sur la gélose un gradient de concentration d’antibiotiques et en déterminant la valeur de la concentration minimale permettant d’inhiber la croissance des pathogènes. Ces gradients de concentration peuvent être obtenus à l’aide de bandelettes ou de disques (figure 2.6). Cette étape, qui permet de déterminer la sensibilité du pathogène à plusieurs familles d’antibiotiques, repose à nouveau sur la croissance des pathogènes.

Des automates de lecture (la gamme Vitek2 (bioMérieux) par exemple) permettent désormais de combiner l’identification et la sensibilité aux antibiotiques, et permettent d’obtenir les résultats dans des délais plus brefs, de l’ordre de 3 à 7h.

Inconvénients de ce déroulement standard

Ces étapes successives permettent donc de détecter et d’identifier le pathogène à l’origine de l’infec-tion, puis d’établir son profil de sensibilité aux antibiotiques, afin de déterminer le traitement le plus efficace, notamment la famille d’antibiotiques à utiliser ainsi que sa concentration minimale efficace pour éradiquer le pathogène. Ces informations, délivrées à temps, sont de nature à permettre la réorientation progressive de l’antibiothérapie pour cibler de plus en plus précisément le pathogène (figure 2.7).

Le diagnostic à partir d’hémocultures est considéré comme un test de routine, et représente environ un tiers de l’activité des laboratoires de microbiologie [Casier, 2004]. Pour le CHU de Grenoble, cela représentait 33 000 hémocultures par an en 2005 [Croize et al., 2007]. Cette succession d’étapes basées sur la croissance bactérienne a l’avantage de donner une information de phénotype bactérien, directement liée au comportement de la bactérie face à un antibiotique. Elle a en revanche un certain nombre d’inconvénients majeurs, qui sont passés en revue ci-dessous.

Temps d’amplification L’hémoculture repose sur une étape de multiplication du pathogène qui dure en moyenne 24 à 72 heures. Ce temps recouvre le temps nécessaire pour que les bactéries, stressées par le milieu très agressif du sang et par les antibiotiques et les modifications de conditions d’incubation liées au prélèvement puis au transport de l’échantillon, reprennent leur croissance : on parle de période de latence. Il recouvre aussi le temps nécessaire à l’obtention d’une concentration suffisante de bactéries pour que leur présence devienne clairement détectable. Il faut en général atteindre une concentration de 108 à 109 ufc/mL. C’est une méthode trop lente devant l’urgence de la situation.

Peu sensible dans certaines circonstances En outre, près de 50% des hémocultures restent néga-tives alors que les signes cliniques indiquent une infection [Dellinger et al., 2008].

En effet, la croissance du pathogène peut être potentiellement ralentie voire inhibée par des condi-tions stressantes comme la présence d’antibiotiques dans l’échantillon. De plus, les hémocultures sont peu sensibles pour la détection de bactéries intracellulaires ou fastidieuses, comme les genres Bartonella, Legionella ou encore Brucella. En outre, la concentration de micro-organismes dans le sang peut être très variable (pics de concentration séparés par des périodes de quasi-absence dans le sang). Le volume d’échantillonnage peut ne pas être suffisant pour garantir effectivement la présence de bactéries dans le volume de culture.

Nouvelles méthodes d’identification

Bilan

Les tests qui requièrent une étape de culture ont donc une faible valeur ajoutée comme méthode de diagnostic car les résultats sont obtenus en général plusieurs jours après le prélèvement, et sont peu sensibles aux micro-organismes fastidieux ou au temps de génération long, ou encore lorsque le patient a déjà reçu une antibiothérapie.

La mise au point d’une méthode plus efficace et plus rapide pour détecter et identifier un pathogène

à l’origine d’une infection du sang est un enjeu majeur pour les laboratoires, afin de permettre d’orienter efficacement et le plus tôt possible la décision thérapeutique et d’améliorer le pronostic vital des patients.

Nouvelles méthodes d’identification

Pour réduire le temps de détection des tests de diagnostic des infections du sang, de nouvelles mé-thodes apparaissent sur le marché. Le but principal de ces nouveaux systèmes est d’éviter les étapes de culture, qui sont chronophages et peu sensibles à certains micro-organismes. La stratégie utilisée consiste alors à détecter et identifier les pathogènes directement dans l’échantillon biologique.

Identification moléculaire

Introduction

Les méthodes moléculaires permettent la détection et l’identification d’un micro-organisme par reconnaissance d’une partie de son matériel génétique. En général, les tests moléculaires peuvent être effectués directement à partir de l’échantillon sanguin (c’est là qu’elles auront l’impact le plus fort sur l’orientation de la décision thérapeutique) ou après une étape de culture, soit à partir de l’hémoculture positive, soit à partir d’une colonie isolée. Dans la suite, nous ne parlerons que des méthodes moléculaires qui permettent d’obtenir un résultat à partir de l’échantillon brut, dans la mesure où les méthodes qui requièrent une première étape de culture présentent les mêmes limitations que les hémocultures décrites précédemment.

Le principe général consiste à amplifier une partie du génome dont la séquence est spécifique à l’identité du pathogène ou à des protéines connues pour être impliquées dans des mécanismes de résistance aux antibiotiques. Les facteurs d’amplification génétique peuvent être gigantesques (jusqu’à 1012 copies). C’est cette amplification qui peut permettre d’éviter l’étape de culture et la multiplication du pathogène entier en amplifiant uniquement son matériel génétique.

Les techniques de biologie moléculaire permettent d’identifier un pathogène à partir de son génome, mais aussi de déterminer la présence de gènes associés à certains mécanismes de résistance aux antibiotiques (comme le gène mecA qui permet à S. aureus de résister à la méticilline [Ubukata et al., 1989]), même si peu de gènes de résistances ont été formellement identifiés. La possibilité d’identifier le pathogène sans étape de culture, et en outre de déterminer certaines caractéristiques de résistance aux antibiotiques, en font des méthodes très prometteuses.

Les tests moléculaires reposent en général sur une succession d’étapes qui permettent de libérer, amplifier et identifier le matériel génétique du pathogène. Ces méthodes nécessitent :

– la lyse du pathogène,

– l’extraction et la purification des acides nucléiques,

– l’amplification d’une ou plusieurs séquence(s) d’acides nucléiques,

– et l’identification des acides nucléiques amplifiés.

La lyse du pathogène se fait en général en utilisant des ultrasons ou des procédés chimiques ou mécaniques. L’extraction et la purification du matériel génétique reposent souvent sur l’utilisation de billes magnétiques (comme le kit NucliSens mini MAG (bioMérieux) ou le kit MagNA Pure LC total nucleic acid isolation kit (Roche)) ou de colonnes d’élution (comme le kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) ou le kit High Pure PCR template preparation kit (Roche)). La méthode d’amplification d’une séquence d’acide nucléique la plus couramment utilisée est la PCR (polymerase chain reaction) [Mullis et al., 1986], et l’identification du matériel amplifié peut se faire par séquençage, par migration sur un gel d’électrophorèse, par marquage fluorescent, ou par spectroscopie de masse.

Les différents tests moléculaires

Il existe ensuite 3 stratégies différentes pour le choix de la séquence à amplifier. On trouve :

– des tests spécifiques, qui permettent la détection d’une seule espèce donnée,

– des tests génériques, qui permettent la détection de n’importe quel pathogène,

– et des tests multiplexes, qui permettent la détection simultanée de plusieurs pathogènes.

PCR universelle La PCR universelle consiste à cibler une séquence d’ADN conservée par tous les micro-organismes, comme le gène ARNr 16s chez les bactéries ou le gène ARNr 18s chez les champignons.

Ces gènes peuvent être amplifiés à l’aide d’amorces universelles, mais comportent des séquences variables d’une espèce à l’autre, donc leur séquençage peut permettre l’identification du pathogène. Le principal avantage de cette méthode est de permettre la détection de n’importe quel pathogène, même s’il est rencontré pour la première fois. Le prix à payer pour cette universalité est néanmoins une identification plus complexe, puisqu’après l’amplification, il faut compléter l’analyse du gène par une méthode de séquençage par exemple, pour remonter à l’identification de la bactérie. Le séquençage reste une étape très coûteuse pour un test de diagnostic, mais permet une approche exhaustive. SeptiTest (Molzym) est un exemple de test universel disponible commercialement pour l’identification de pathogène dans le sang qui repose sur cette méthode. PCR spécifique A l’inverse de l’amplification universelle, il est possible de cibler un gène particulier à une espèce en utilisant des amorces spécifiques. Si la séquence ciblée n’est pas présente dans le génome du pathogène, il n’y aura pas d’amplification.

Une méthode de détection par PCR de S. aureus en moins de 2h directement dans le sang a été décrite récemment [Banada et al., 2012]. Elle repose sur l’utilisation d’un système automatisé dérivé de la plateforme GeneXpert System (Cepheid) et garantit un seuil de détection de 10 ufc/mL.

Néanmoins, le choix des sondes à utiliser pour la détection doit en général être guidé par une première observation microscopique du pathogène : en condition clinique, cette méthode ne permet donc pas de s’affranchir de l’étape d’hémoculture. En revanche, elle peut être particulièrement utile pour cibler un gène de résistance, comme le gène de résistance à la méticiline chez S. aureus. PCR multiplexe La PCR multiplexe parait être un bon compromis entre les 2 méthodes. En effet, elle permet l’utilisation simultanée de plusieurs sondes spécifiques, donc permet de cibler plusieurs pathogènes différents dans un même test.

Plusieurs kits commerciaux permettent une détection de pathogène par PCR multiplexe directe-ment dans le sang, notamment SeptiFast (Roche) et VYOO (Looxster). La plupart de ces systèmes permettent, en plus de l’identification du pathogène, de détecter la présence de certains gènes de résistance aux antibiotiques (en particulier la résistance à la méticilline, à la vancomycine, et à la famille des bêta-lactamines).

L’inconvénient majeur du multiplexage est une perte de sensibilité : mélanger plusieurs sondes PCR ciblant différents pathogènes peut induire une compétition entre les amplifications.

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Table des matières

Introduction
I Contexte
1 L’intérêt du diagnostic des maladies infectieuses
1.1 Impact des maladies infectieuses
1.1.1 Etat des lieux
1.1.2 Agents infectieux
1.1.3 Lutte contre les maladies infectieuses : grandeur et décadence des thérapies
1.1.3.1 Nouvelles maladies infectieuses et propagation rapide
1.1.3.2 Emergence de pathogènes résistants
1.1.3.3 Découverte de pathogènes oncogènes
1.2 Focus sur les infections du sang
1.2.1 Avant-propos
1.2.2 Conséquences des septicémies
1.3 Objectifs du diagnostic des maladies infectieuses
1.3.1 Intérêt des tests de diagnostic in vitro
1.3.2 Septicémie : cahier des charges des tests de détection
2 Diagnostics des infections du sang
2.1 Méthodes actuelles
2.1.1 Stratégie générale
2.1.2 Amplification et détection de la charge bactérienne
2.1.2.1 Amplification : l’hémoculture
2.1.2.2 Détection : les automates
2.1.3 Coloration de Gram et examen microscopique
2.1.4 Isolement
2.1.5 Identification phénotypique
2.1.6 Antibiogramme
2.1.7 Inconvénients de ce déroulement standard
2.1.8 Bilan
2.2 Nouvelles méthodes d’identification
2.2.1 Identification moléculaire
2.2.1.1 Introduction
2.2.1.2 Les différents tests moléculaires
2.2.1.3 Limitations
2.2.2 Identification chimiométrique
2.2.2.1 Spectrométrie de masse
2.2.2.2 Spectroscopie optique
2.2.2.3 Limitations
2.3 Conclusion : un vrai besoin pour de nouvelles méthodes de préparation d’échantillon
II Microsystèmes pour le tri cellulaire
3 État de l’art sur les méthodes de décomplexification d’échantillons biologiques
3.1 Le domaine du tri et de l’extraction de particules biologiques
3.1.1 Tests d’extraction de cellules particulières dans le sang
3.1.2 Méthodes classiques d’extraction
3.2 Essor de la microfluidique
3.2.1 Intérêt : intégration
3.2.2 Microfluidique pour le diagnostic in vitro
3.3 La mécanique des fluides dans les systèmes miniaturisés
3.3.1 Régime laminaire
3.3.2 Action d’une force extérieure
3.3.3 Profil parabolique
3.3.4 Bilan
3.4 Méthodes passives
3.4.1 Tri en fonction de la présence d’antigènes
3.4.2 Tri en fonction de la taille
3.5 Méthodes actives
3.5.1 Stratégie
3.5.2 Forces optiques
3.5.3 Forces magnétiques
3.5.4 Forces électriques
3.5.5 Forces acoustiques
3.5.6 Bilan
3.6 Conclusion : vers l’utilisation de l’acoustophorèse et de la diélectrophorèse
4 Expériences préliminaires
4.1 DEP avec un mélange de globules rouges et de levures C. albicans
4.1.1 But et mise en place de l’expérience
4.1.2 Description et interprétation de l’expérience
4.2 Stratégie en 2 modules
III Module d’échange de milieu : modification du facteur de Clausius-Mossoti
5 Changer le milieu pour modifier le comportement diélectrophorétique des cellules
5.1 Influence de la conductivité du milieu sur Re[fCM]
5.1.1 Modélisation d’une cellule sanguine : sphère monocouche
5.1.2 Modélisation d’une levure : sphère double-couche
5.1.3 Modélisation d’une bactérie : ellipsoïde double-couche
5.1.4 Bilan
5.2 Influence de l’osmolarité du milieu sur une cellule
5.2.1 Généralités
5.2.2 Observations expérimentales
5.2.2.1 Effet du choc osmotique sur les globules rouges
5.2.2.2 Effet du choc osmotique sur les globules blancs
5.2.2.3 Effet du choc osmotique sur les micro-organismes
5.2.3 Bilan
5.3 Caractérisation des propriétés diélectriques des cellules par électro-rotation
5.3.1 Caractérisation théorique
5.3.1.1 Etat de l’art et démarche scientifique
5.3.1.2 Influence des paramètres de la cellule
5.3.1.3 Conclusion
5.3.2 Caractérisation expérimentale
5.3.2.1 Préparation des échantillons
5.3.2.2 Description du banc expérimental
5.3.2.3 Critère d’acceptabilité
5.3.2.4 Obtention des spectres
5.3.2.5 Détermination des paramètres
5.4 Bilan : propriétés du milieu pour permettre une capture des micro-organismes par DEP+ 94
5.4.1 Détermination des propriétés optimales
5.4.2 Obtention des propriétés optimales
6 Optimisation du module d’échange de milieu : l’acoustophorèse 97
6.1 Rappels théoriques
6.1.1 Principe général
6.1.2 Intégration de cette étape à notre protocole
6.2 Mise en place du banc expérimental
6.2.1 Génération d’une onde acoustique
ixTable des matières
6.2.2 Obtention d’une onde acoustique stationnaire
6.2.3 Choix du matériau
6.2.4 Conception des puces
6.2.5 Fabrication des puces
6.2.6 Montage pour assurer la transmission des ondes acoustiques
6.2.7 Description du banc expérimental
6.3 Expériences préliminaires : performances du microsystème pour la manipulation de
billes et de cellules par forces acoustiques
6.3.1 Essais sur particules modèles
6.3.1.1 But des premières expériences
6.3.1.2 Paramètres expérimentaux et résultats
6.3.1.3 Conclusions
6.3.2 Essais sur du sang complet et sur des bactéries E. coli
6.4 Conclusion et perspectives
IV Module de DEP : optimisation du tri cellulaire 113
7 Capture de cellules sanguines et de micro-organismes par DEP sans flux 115
7.1 Rappels théoriques
7.1.1 Interaction champ-cellule
7.1.2 DEP+, DEP- et électrophorèse
7.2 Modèle numérique et résolution par éléments finis
7.2.1 Géométrie et conditions aux limites
7.2.2 Répartition du champ électrique et force de DEP
7.2.3 Positions d’équilibre DEP+/DEP-
7.3 Validation expérimentale des zones de capture DEP+/DEP-
7.3.1 Montage expérimental
7.3.1.1 Description des microsystèmes
7.3.1.2 Description du banc expérimental
7.3.2 Manipulation et capture de E. coli
7.3.3 Manipulation et capture de C. albicans
7.3.4 Séparation des différentes populations cellulaires
7.3.4.1 Préparation des échantillons
7.3.4.2 Expériences de séparation
7.4 Bilan des forces
7.4.1 Gravité
7.4.2 DEP
7.5 Conclusion
8 Optimisation du microsystème de capture par diélectrophorèse 137
8.1 Influence de la couche de passivation
8.1.1 Etude en utilisant un modèle analytique
xTable des matières
8.1.2 Etude en utilisant un modèle numérique
8.1.3 Comparaison des résultats des modèles analytique et numérique
8.1.4 Conclusion
8.2 Optimisation de la hauteur du microsystème
8.2.1 Simulation numérique
8.2.2 Lois d’échelle
8.2.3 Bilan
8.3 Fabrication de microsystèmes avec différents réseaux d’électrodes
8.3.1 Architecture des microsystèmes
8.3.2 Fabrication
8.4 Influence de la structure du réseau d’électrodes interdigitées sur la force de DEP
8.4.1 Influence de la largeur du gap
8.4.1.1 Etude numérique
8.4.1.2 Etude expérimentale
8.4.1.3 Conséquence sur la viabilité des micro-organismes
8.4.2 Influence de la largeur des électrodes
8.5 Conclusion
9 Résultats expérimentaux de capture en flux de micro-organismes avec le micro-système
optimisé 153
9.1 Influence du flux
9.2 Choix de la fréquence pour effectuer une capture générique des micro-organismes . . 155
9.2.1 Comportement diélectrophorétique des différents types cellulaires
9.2.2 Comparaison entre les simulations et les valeurs expérimentales
9.2.3 Validation expérimentale
9.3 Extraction des micro-organismes dans un échantillon sanguin
9.3.1 Préparation des échantillons
9.3.2 Description du banc expérimental
9.3.3 Résultats qualitatifs d’extraction
9.3.4 Résultats quantitatifs de capture
9.3.5 Résultats quantitatifs de relargage
9.4 Viabilité
9.4.1 Facteurs altérant la viabilité des micro-organismes
9.4.1.1 Influence de la température
9.4.1.2 Influence du champ électrique
9.4.2 Résultats expérimentaux
9.5 Bilan et conclusion
V Conclusions et perspectives 171
10 Conclusion 173
xiTable des matières
11 Perspectives 177
11.1 Etudes complémentaires
11.2 Propositions pour améliorer le débit
11.2.1 Largeur du canal et des électrodes
11.2.2 Hauteur du canal
11.2.3 Parallélisation
11.3 Nouvelle architecture : vers l’intégration dans un consommable microfluidique
Bibliographie 192
Annexes 19