Préparation des échantillons par les détergents et les agents dénaturants

Plusieurs facteurs intrinsèques des particules affectent leur migration :

La charge globale ou charge nette : les particules chargées à un pH et une force ionique donnés vont migrer :

– Les particules chargées – (pH> pHi) migrent vers l’anode ;

– Les particules chargées + (pH< pHi) migrent vers la cathode ;

Ce paramètre est le plus important car il déterminele sens de la migration, ainsi que la vitesse. La distance parcourue par la particule chargée est proportionnelle à sa charge.

La taille : les particules sont soumises à des forc es de friction (frottements) avec le support. Ces forces augmentent avec la taille. C’est un paramètre également très important (la densité ed charge d’une particule dépend en effet de sa taille). Elle est parfois le critère de séparation des particules, si l’on « annule » les paramètres charges et formes. La distance parcourue par la particule chargée est inversement proportionnelle à sa taille.

La forme : une particule en pelote (globulaire) présentera moins d’interaction avec le support et migrera donc plus vite qu’une particule fibrillaire [4].

La migration des particules dépend aussi des paramètres extrinsèques:

Le champ électriqueE

Le champ électriqueE représente le potentiel Vpar unité de longueur L. Si Lest la distance entre les deux électrodes, on conçoit que pour une même valeur de potentiel V, le champ électrique E soit d’autant plus élevé que les électrodes sont rapprochées : EV1 L

Par ailleurs, on peut l’exprimer autrement en remplaçant dans la relation (1) le potentiel V par sa valeur donnée par la loi d’Ohm (V = R. I). Sachant que : R  I.L2 .S

Avec :

R= Résistance de la particule en mouvement

I= Intensité du courant électrique

L= Distance entre les deux électrodes

c = Conductivité de la solution

S= Section du support

Alors : E I 2 3  .S

Il apparaît ainsi que la valeur du champ dépend de l’intensité I et de la composition de la solution, puisque la conductivité χ est proportionnelle à la concentration des ions donc à la force ionique. Ain si pour moduler une séparation, il est théoriquement possible de fairevarier les facteurs suivants :

– La distance entre les électrodes L et la section du support S, facteurs dépendants de la construction de la cuve électrophorétique et de la nature du support, ne peuvent être commodément changés ;

– La valeur de l’intensité I ne peut non plus être modifiée de manière importante, car il est nécessaire qu’elle reste toujours faible afin d’éviter les dégagements de chaleur qui, se produisant par effet Joule, entraînent des phénomènes d’évaporation et la dénaturation dessubstances thermolabiles ;

– Le temps de migration t ne peut pas être allongé sans risque d’augmenter les phénomènes de diffusion ;

– La variation de la concentration ionique n’est possible que dans certaines

limites car dans ce cas, on modifie non seulement la valeur du champ électriqueE, mais également la mobilité des particules [9].

Les courants liquidiens

Les courants liquidiens sont particuliers à l’électrophorèse sur support ; ils vont différencier ce type de migration par rapport à l’électrophorèse en veine liquide. On les considère comme des facteurs principaux, puisque c’est à cause d’eux que la relation d.E.t n’est pas vérifiée.

Avec :

d= migration des particules

m = mobilité électrophorétique des particules

E= Champ électrique

t= Temps de migration des particules

Il existe trois sortes de courants liquidiens [5].

– Le courant d’électro-endosmose

Dans certaines conditions d’une électrophorèse de zone, le support se charge négativement. Ainsi, la couche mobile de charges positives migre dans la direction du champ entrainant globalement la phase liquide vers la cathode.

Ce courant accélère ou ralentit la migration des particules, suivant qu’elles migrent vers la cathode ou vers l’anode (figure 7). Ces déplacements doivent évidemment être pris en considération lors de la terminationdé des mobilités électrophorétiques. Ils sont négligeables pour lesgels de polyacrylamide. Ils sont importants pour les supports de type papier, acétate de cellulose et encore plus pour les gels d’agarose, où il est possible qu’ils soient plus puissant que les forces électriques, ce qui fait que des particules chargées négativement peuvent globalement migrer vers la cathode. C’est particulièrement vrai avec les gels d’agarose et dans le cas de l’électrophorèse capillaire [10].

– Le courant d’évaporation (ou de rhéophorèse)

L’eau s’évapore au niveau de la surface de la bande. En effet, Comme celle-ci plonge dans le tampon, il s’établit depuis chaque extrémité un courant liquide qui tend à compenser cette évaporation. De ce fait, l’évaporation dévient maximale au milieu de la bande, il s’établit un courant liquidien depuis chaque extrémité (figure 8)[10].

Figure 8: Les courants d’évaporation [10].

– Le courant d’électrolyse

Ce courant de liquide s’établit lorsque, à la suite de la décharge des ions sur des électrodes, il y a modification de la composition du tampon dans les compartiments d’électrodes [4].

La durée de migration

En électrophorèse libre, la migration d est proportionnelle à la durée d.E.t. Comme il a été vu précédemment, la particule esoumiset à un certain nombre de forces ; lorsque le bilan des vitesses de déplacement est nul, la particule ne se déplace plus, quelle que soit ladurée d’application du champ R E .

Lorsque le dépôt est fait du côté cathodique de la bande, la zone où la résultante des vitesses est nulle, se situe généralement dansla moitié anodique. Il en résulte donc qu’il est inutile d’augmenter exagérément la durée de migration.

De plus, concernant le support poreux favorisant la diffusion des protéines, une grande durée aboutirait à l’étalement des zones. Celles-ci se superposeraient et le pouvoir de résolution de l’électrophorèse s’en rouverait par conséquent diminué[11].

Les facteurs liés à la nature du support

Les propriétés adsorbantes du support se manifestenà l’égard des particules et vont en ralentir la migration. La texture du support joue un rôle primordial. Le support présente des canaux sinueux dans lesquels migrent les particules. La distance de migration mesurée est par conséquent nettement inférieure au déplacement réel, ce qui explique qu’en électrophorèse de zone, on ne mesure qu’une mobilité apparente [12].

Ce genre de montage est surtout utilisé pour les supports comme l’acétate de cellulose ou le papier où les échantillons se déplacent horizontalement à sa surface. Le support est sous forme de bande (de papier ou d’acétate de cellulose) longue et généralement étroite[13].

Les échantillons sont d’abord déposés à la surfacedu support à l’aide d’un applicateur.

Le support est ensuite placé dans une cuve pour électrophorèse où se trouve une solution tamponnée (figure 9).

Enfin les deux bouts du support sont plongés dans le tampon (solution d’électrolytes) ce qui permet de créer une mince couche d’eau à sa surface. Dans cette mince couche, les ions se déplacent à la surface, créant le courant qui entraînera les diverses particules de l’échantillon qui migreront suivant leur charge.

On utilise aussi des montages horizontaux pour des supports d’agarose lors de l’électrophorèse d’acides nucléiques[10].

Ce genre de montage est surtout utilisé pour les supports comme le gel de polyacrylamide. Car cette substance s’attache sur le verre sans glisser. Ce montage est rarement utilisé pour le gel d’agarose en raison de sa faible affinité pour le verre. Pour ce type de montage, les échantillons se déplacent verticalement à l’intérieur du support. Le support (matériel gélifié) est coulé entre deux plaques de verre ou dans un tube cylindrique. Le gel est souvent préparé peu de temps avant usage pour former un « andwichs » plaque de verre / gel / plaque de verre. Durant la formation du gel, on crée des puits où seront déposés les échantillons.

Chaque extrémité du gel sera mise en contact avec nu tampon contenant des électrolytes qui, soumis à un potentiel électrique,permettra la propagation d’un courant dans le gel. Ce courant entraînera les particules contenues dans l’échantillon. Cette migration permettra la séparation des diverses espèces particulaires qui migreront à des vitesses différentes (figure 10).

On peut en général contrôler la migration par le réglage du potentiel V et de l’intensité I du courant électrique appliqué,de la composition des tampons (résistance du système tampon). Certains facteurs onts cependant plus difficiles ou impossibles à contrôler comme l’affinité pour le support [7,10].

Habituellement employé dans un montage horizontal,il sert surtout à séparer des acides aminés ou d’autres petites particules chargées. Le dépôt et la migration des échantillons se font en surface. La présence decharges sur la cellulose qui constitue le papier interfère un peu avec la migration. Il est de moins en moins utilisé sauf, quelques fois, pour la séparation desacides aminés sous très haut voltage [11].

Il s’agit d’un dérivé acétate d’une forme purifiéede cellulose. Elle se présente sous la forme d’une mince et fragile feuille. Le dépôt et la migration se font en surface sur un montage horizontal. On s’en sert beaucoup pour séparer grossièrement des protéines. Son faible coût et sagrande facilité d’emploi la rend utile pour la séparation des protéines sériques, particulièrement en biochimie clinique.

Cependant sa faible résolution ne permet que la séparation de grands groupes de protéines[14].

On peut polymériser l’acrylamide entre deux plaquesde verre ou à l’intérieur de tubes cylindriques de verre, où il formera un gel poreux. On dépose l’échantillon sur le sommet du gel de polyacrylamide, maintenu vertical. Les particules pourront alors migrer à l’intérieur de ce gel. Ce support électriquement inerte n’entrave pas la migration, permettant des séparations de hautes résolutions. Les gels de polyacrylamide servent couramment à la séparation des protéines. Ils sont aussi souvent utilisés pour les acides nucléiques de petites tailles, particulièrement dans le séquençage[15].

Cette substance très hydrophile peut même à très basse concentration, de l’ordre de 1%, former des gels solides mais très poreux. L’agarose ne polymérise pas par création de liens covalents, il se gélifie à basse température. Cette gélification est due à la formation d’une multitude de liens hydrogène entre les longues particules linéaires de dextran qui composent l’agarose. Sa faible adhésion au verre oblige généralement à étaler ceelg sur une plaque de verre maintenue horizontale. Sa grande porosité le rend rèst utile pour séparer les particules ou les complexes particulaires de grandes tailles. C’est un support très souvent utilisé pour l’électrophorèse des acides nucléiques. De plus en plus, on utilise ce support pour la séparation des protéinessériques. Les laboratoires de biochimie clinique utilisent des versions automatisées avec des cassettes de gel d’agarose souvent colorables automatiquement [15].

Rarement utilisé de nos jours, ce support forme un gel poreux. Les gels d’amidon servaient à séparer les protéines destinée à des colorations enzymatiques [7].

Dans la grande majorité des cas, les particules ne sont pas visibles à la séparation. D’où il faut procéder à leur colorationafin de pouvoir les analyser. On peut colorer l’ensemble des particules séparéesou seulement un petit sous-groupe spécifique. Les techniques de coloration varient avec le type de support utilisé[11].

Lorsqu’il s’agit des protéines, celles ci sont généralement incolores. Leur visualisation sur les supports d’électrophorèse s’effectue par des procédés histochimiques in situ qui permettent soit de colorer les produits de dénaturation de la protéine ou une partie chimique qui lui est associée, soit d’obtenir un précipité coloré à l’emplacement de cette protéine n utilisant ses propriétés catalytiques ou antigéniques[16].

Les différentes techniques de révélation utiliséessont :

les techniques de coloration utilisant :

l’amidoschwarz, le rouge ponceau : Electrophorèse sur papier, électrophorèse sur acétate de cellulose et électrophorèse sur gel d’amidon ;

le bleu de Coomassie, les sels d’argent : Electrophorèse sur gel d’agarose et électrophorèse sur gel de polyacrylamide ;

le  réactif  de  Schiff :  Electrophorèse  sur  papier  et électrophorèse  sur acétate de cellulose ;

les techniques de détection d’une protéine par un nticorpsa la reconnaissant spécifiquement, par simple visualisation de l’arc de précipitation entre anticorps et antigène : immunoélectrophorèse.

Ici on utilise généralement le Noir Soudan pour l’électrophorèse sur papier et électrophorèse sur acétate de cellulose.

Le colorant souvent utilisé est la Ninhydrine pour l’électrophorèse sur papier et électrophorèse sur acétate de cellulose.

La plus courante des techniques actuellement utilisées pour visualiser des acides nucléiques est l’utilisation du Bromure d’éthidium(BET).

Des hétérocycles organiques à noyaux accolés commele BET se lient à l’ADN bicaténaire par intercalation. Ils occupent un site interbase sur deux jusqu’à saturation. Ce type de liaison est dit par «exclusion du voisinage ». Les intercalants sont séparés les uns des autres par des intervalles de 10,2 Å.

Le BET (concentration d’utilisation finale : 0,5 µg / ml) est extrêmement dangereux et nécessite de porter des gants pour manipuler les gels lors de la révélation et après.

Il existe des méthodes de coloration des acides nucléiques qui ne nécessitent pas l’emploi de BET (considéré comme extrêmement dangeux)r. Mais ces méthodes sont moins sensibles et présentent une coloration de fond parfois difficile à éliminer.

Parmi ces méthodes de coloration utilisées on peutciter :

la coloration par le bleu de méthylène ; la coloration par l’azure A ;

la coloration par le bleu de toluidine ;

la coloration au bleu de Nile.

Cette dernière semble une méthode alternative intéressante à considérer. En effet, elle est à la fois sensible et non dangereus e. La coloration de fond est nettement moins intense et le bleu de Nile restant est facile à éliminer par simple lavage à l’eau distillée.

L’électrophorèse sur gel est une des méthodes de routine les plus performantes pour séparer des particules (acides nucléiques, protéines de hauts poids moléculaires).
Les gels couramment utilisés sont le polyacrylamide et l’agarose. Ils ont des pores de dimensions particulaires dont on peut spécifier la taille.
Ces gels ont pour effet de ralentir la migration des grosses particules par rapport aux plus petites.
Les pores de très grandes tailles nécessaires pourséparer par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE), des composés de hauts poids moléculaires (>200 kD) nécessitent des gels dont la concentration en polyacrylamide est si faible (<2,5%) qu’ils sont trop mous pour être utilisés.
Cette difficulté est contournée en utilisant des gels d’agarose. Par exemple, un gel d’agarose à 0,8% est utilisé pour séparer des acides nucléiques dont le poids moléculaire peut atteindre 50000 kD.
Pour une meilleure séparation des particules, des amponst sont ajoutés dans les gels pendant la migration des particules. Il s’agit des tampons de migration et des tampons de chargement [20]. Les tampons de migration
La mobilité électrophorétique des particules est fectéeaf par la composition et la résistance ionique du tampon d’électrophorèse.
En effet, en l’absence d’ions, la conductance électrique est minimale et les particules migrent lentement, voire pas du tout. Les particules migrent ainsi avec une vitesse proportionnelle à la concentration ionique du tampon.
Pour un tampon à résistance ionique élevée, la conductance électrique est très efficace. Par contre si, le tampon a une résistance très élevée, la conductance électrique le sera aussi et une quantité importantede chaleur est générée. Dans le pire des cas, le gel se met à fondre et les particu les se dénaturent.
Les tampons de migration servent donc à maintenir le pH constant, assurer la solubilité desparticules qui migrent, et permettre une bonne séparation ou une bonne résolution.
Les tampons doivent aussi être le plus possible inertes vis-à-vis des particules, et immobiles (leur mobilité peut modifier la migrationdes particules chargées). Les tampons les plus utilisés sont :
Le tris-borate-EDTA (TBE) ou le tris-acétate-EDTA (TAE) pour les acides nucléiques;
Le tris-glycine ou le tris-tricine pour les protéines.
Ces tampons sont généralement préparés sous forme dsolutions et conservées à température ambiante[4,21].
Les tampons de chargement
Les échantillons à séparer sur les gels sont mélangés à un tampon de chargement composé généralement d’eau, de saccharose et d’une teinture comme du xylène cyanol, du bleu de bromophénol, duvert de bromocrésol, etc… La quantité maximale de particules pouvant être chargées dépend du nombre de fragments. La quantité minimale de particules pouvant être détectées par la photographie des gels teintés au bromure d’éthidium tourne autour des 2 ng sur une bande de 0,5 cm de largueur. Si une largeur de bande renferme plus de 500 ng de particules, le sillon sera surchargé, ce qui produira une traînée. Le tampon de chargement a un triple objectif :
Il augmente la densité de l’échantillon en faisanten sorte que les gouttes de particule tombent de façon harmonieuse dans les puits;
Il ajoute de la couleur à l’échantillon, simplifiant ainsi le processus de chargement;
Il attribue une teinture à l’échantillon qui, dans un champ électrique, évolue vers l’anode à une vitesse prévisible[22].

L’utilisation de détergents dans la préparation des échantillons avant l’électrophorèse est courante. Ils servent à dissocier les protéines pour éviter qu’elles ne forment des agrégats impossibles à séparer. La partie hydrophobe du détergent peut en effet interagir avec les chaînes latérales non chargées tandis que la partie hydrophile interagit avec les particules d’eau. Cela permet la solubilisation maximale des protéines et le déploiement de ses parties hydrophobes. Certains détergents comme le Sodium DodecylSulfate (SDS) servent aussi à détruire la structure quaternaire des protéines pour séparer les protéines multimériques en leurs polypeptides individuels. La plupart des protéines peuvent complexer de grandes quantités deSDS (environ 1,4 g de SDS par gramme de protéine). Cela représente une moyenne de deux particules de SDS par résidu d’acide aminé. Cette quantité deSDS complexée aux protéines est tellement grande que les protéines prennent une charge négative nette.
Les charges endogènes sont tellement peu nombreuses par rapport à celles apportées par le SDS, que toutes les protéines ont,à toute fin pratique, une densité de charge uniforme. Citons pour exemple l’ovalbumine, une protéine de 43kD, qui possède une charge nette de -10 à pH 7,0 et de -200 après dénaturation au SDS.
Dans certains cas, les protéines peuvent être dénaturées sans changer leur charge. Les dénaturants alors utilisés sont des agents chaotropiques non ioniques comme l’urée [21].

Il existe divers types d’agents de réticulation ou agents pontants qui auront des propriétés  différentes, permettant de préparer desgels appropriés pour divers usages :
* Le N, N’-méthylène bis acrylamide, plus communémentappelé « bis » ou « bis acrylamide » : est l’agent réticulant le plus utilisé. Structuralement, il peut être décrit comme l’équivalent de 2 monomèresd’acrylamide liés par un groupement méthyle entre les deux atomes d’azote. Les liens chimiques du gel obtenu sont très stables et le gel est suffisamment solide pour être facilement manipulé.
* Le diacrylamide de pipérazine est un autre agent réticulant. Il permet d’obtenir des gels un peu plus solides et avec une résolution améliorée. Son principal avantage est de donner un bruit de fond moins grand que le bis dans une coloration à l’argent. Il est cependan t plus cher.
* Le BAC (N, N’- Bis Acrylyl Cystamine) possède des ponts disulfures qui peuvent être détruits par un réducteur comme le mercapto-2-éthanol par exemple.
* Le DATD (N, N’- DiAllyl TartraDiamide) possède des liaisons de type diol, donnant un gel solubilisable à l’acide périodique, ce qui est pratique pour les comptages de radioactivité. Il donne aussides mailles de gel plus grandes, ce qui est avantageux pour certaines protéines, mais désavantageux dans la plupart des cas à cause de la perte de résolution qui s’ensuit…
* Le DHEBA (N, N’- DiHydroxy Ethylene Bis Acrylamide) a des liaisons de type diol et amido-méthylol qui peuvent être détruites par l’acide périodique ou une base.
* D’autres agents de réticulation peuvent être utilisés si on veut des gels « resolubilisables » après séparation des protéines,de façon à pouvoir récupérer ces dernières pour analyse ou toute autreutilisation. Mais, ces produits donnent souvent des gels plus fragiles ou plus cassants. De plus, la quantité optimale pour séparer des protéines depoids moléculaire donné reste à être déterminée[21].

Le gel de polyacrylamide est fabriqué en mélangeant les composantes de base : acrylamide, agent réticulant, tampons, détergents,etc. Quelques secondes avant de « couler » le gel, le catalyseur et l’accélérateur sont ajoutés puis versés immédiatement dans un moule avant que la solution d’acrylamide n’ait eu le temps de gélifier. Le gel est laissé polymériser etdevient alors solide. Le moule contenant le gel solide est alors prêt à être introduit dans la cellule à électrophorèse. Les échantillons sont d’abord ajoutés, ensuite le gel est mis sous tension dans les conditions de voltage et de courant pour que les protéines migrent à la vitesse voulue. On démoule enfin le gel pour colorer les protéines ou les soumettre à d’autres analyses (immunodétection, etc.).
Les échantillons sont dissous généralement dans duglycérol ou du saccharose contenant divers produits facilitant les procédures. Ces tampons sont destinés à augmenter la densité de l`échantillon. Plus l’échantillon est dense, plus il est stable au niveau de l’électrode. Pour faciliter la visualisation de la migration, un traceur de migration comme le bleu de bromophénol est couramment ajouté dans l’échantillon. Ce produit coloré, migre justederrière le front d’ions, ce qui permet de visualiser facilement la migration. L’électrophorèse est arrêtée quand le traceur a atteint le bas du gel.
De nos jours, les gels d’acrylamide sont essentiellement sous forme de gels plats où peuvent être creusés plusieurs puits permettantde séparer côte à côte plusieurs échantillons. Ceci est très utile pour comparer le contenu en protéines de plusieurs sources différentes. Ces gels plats se présentent sous forme de « sandwich » grâce à deux plaques de verre entre lesq uels on laisser un espace de 0,5 à 1,5 mm d’épaisseur dans lequel on introduit la solution liquide d’acrylamide.
Par ailleurs, les gels cylindriques ou en carotte sont très peu utilisés de nos jours, sauf pour les séparations bidimensionnelles où la polymérisation se fait dans des tubes de verre de moins de 5 mm de diamètre interne. Chaque échantillon est mis dans un tube individuel. Certains prétendent que les cylindres donnent une meilleure séparation et sont plus fiables[21].

La principale caractéristique d’un gel de polyacrylamide est la taille des pores. Plus les pores seront petites, plus les grosses particules auront de la difficulté à avancer dans le gel, donc plus elles seront retardées. Inversement les particules très petites pourront s’infiltrer et avancer dans le gel sans obstacle. On utilisera donc diverses grosseurs de porosités selon que les protéines que l’on veut séparer sont petites ou grosses. Pour une gamme de taille relativement réduite, les protéines trop grosses seront toutes ralentieset se démarqueront mal les unes des autres. Quelque fois, elles ne pourront même pas entrer dans le gel. Par contre, les protéines trop petites ne seront presque pas ralenties car l’effet de tamisage est négligeable. Elles migreront toutes pratiquement à la même vitesse. Il faut donc choisir la concentration d’acrylamide et d’agent réticulant adéquat pour optimiser la migration des protéines que l’on désire séparer. On essaie de prendre une porosité telle, que les protéines en question migreront dans la partie centrale du gel de séparation. Ce choix repose sur deux facteurs principaux qui influenceront la taille des pores du gel : la quantité d’acrylamide et le rapport bis acrylamide / acrylamide (ou plus généralement : agent réticulant / acrylamide).En effet, plus il y a d’acrylamide en solution au moment de la polymérisation, plus les pores seront petites. De même, plus le rapport bis / acrylamideest élevé, plus les pores seront petites. Aussi, plus il y a de bis, plus les chaînes d’acrylamide seront réticulées, donc plus les pores seront petits [21].

La façon la plus simple de visualiser la migration des protéines est de les colorer. Avant de procéder à cette coloration, il faut fixer les protéines. En effet, lorsque la tension électrique est élevée, les protéines ont tendance à diffuser dans le gel. Ceci va évidemment diminuer la résolution de la séparation. C’est pour éviter cette diffusion que les protéines sontfixées dans le gel. Elles sont précipitées dans le gel formant des agrégats de protéines intimement entremêlées dans les pores du gel qui ne peuvent plus diffuser. Cette fixation se fait normalement en mettant le gel dans un acide dilué comme l’acide acétique ou l’acide trichloroacétique (1 à 10 %). Cette fixation peut être omise si le colorant lui-même contient de l’acide dilué, cela permet defixer les protéines en même temps qu’on les colore.
Le colorant le plus couramment utilisé est le bleu de Coomassie. Ce produit, en milieu acide et en présence du méthanol, a une grande affinité pour les protéines. Sa petite taille lui permet de pénétrerapidement dans le gel pour atteindre les protéines. Sa solubilité dans l’acide permet de combiner la coloration des protéines et leur fixation. Après uncertain temps de contact, le gel peut être transféré dans une solution méthanolique acide pour enlever l’excès de colorant empêchant de voir les protéines. A lainf de cette décoloration, le gel est transparent avec les bandes de protéines colorées en bleu (figure14). Le bleu de Coomassie est assez sensible. Il existe deux variétés de bleu de Coomassie. Le R250 est utilisé pour colorer les grosses protéines et le G250 est plus indiqué pour les petites protéines et les polypeptides séparés dans des gels de fort pourcentage. En effet, le G250 est une suspension colloïdale. Ce colorant est assez sensible (limite de détection 0,5 µg) et convient à la plupart des électrophorèses.