Les antioxydants et système de protection contre les radicaux libres

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Usages empiriques

Les fruits d’une manière générale les gousses et les graines ont une saveur parfumée et poivrée. Ils sont principalement utilisés dans l’alimentation (Tatsadjieu et al., 1995). On les emploie comme condiments et succédanés du poivre. Dans l’alimentation, ces fruits secs sont utilisés entiers ou écrasés comme aromatisant (Dupriez et al., 1987).
Par ailleurs c’est un remède stimulant et tonique. Il est conseillé aux nouvelles accouchées comme reconstituant : piler les fruits dans un peu d’eau, en faire une décoction dans un demi-litre d’eau que l’on donne à boire le matin à jeune.
Au Sénégal le Xylopia parfume le Café Touba, une boisson traditionnelle de la confrérie des mourides, mais dont la consommation s’étend dans les villes au-delà de la confrérie.
Dans certains pays, les fruits secs de Xylopia aethiopica sont utilisés en pharmacopée traditionnelle contre plusieurs affections notamment dans le traitement de la bronchite, de la dysentérie, de la stérilité et des aménorrhées chez la femme (Adjanohoun et al., 1988).
Antihelminthique, elle expulserait les vers quand, après un jeune de 24 heures, on la prend en mangeant.
En plus ses propriétés insecticides permettent de combattre les ravageurs de stocks (Okonkwo et Okoye, 1996), mais également les termites et autres insectes qui s’attaquent au bois (Ladji et al., 1995).
Elle est également utilisée au Togo par les herboristes pour le traitement des contusions musculaires (HELE et al., 2014).
Utilisée en décoction, elle fait partie des plantes les plus consommées sur les marchés d’Abidjan (en Côte d’Ivoire) dans le traitement traditionnel de la diarrhée (AMBE et al., 2015).
Le tableau II suivant donne les indications médicinales des différentes parties de la plante en fonction de quelques pays (EKLU-NATEY et al., 2011).

Généralités sur les radicaux libres et le stress oxydatif

Un radical libre est une espèce chimique (atome ou molécule) qui possède un électron célibataire sur sa couche externe (Toussaint, 2008). Leur principal danger vient des dommages qu’ils peuvent provoquer lorsqu’ils réagissent avec des composants cellulaires importants comme l’ADN ou la membrane cellulaire, avec un risque de multiplication anormale des cellules, entrainant un dysfonctionnement ou une mort cellulaire, un cancer.

En effet, sous l’action des rayons UV, de radiations ionisantes, de métaux de transition et au cours de diverses réactions enzymatiques, des formes hautement réactives de l’oxygène apparaissent telles que l’oxygène singulet O2, le peroxyde d’hydrogène H2O2, le radical super oxyde O2●, les peroxydes alkyles ROOH et les radicaux hydroxyles HO●, peroxydes ROO● et alkoxyles RO●. On les désigne souvent comme les espèces réactives de l’oxygène (ERO).

Ces dernières sont produites de manière continue au sein de l’organisme dans le cadre de nombreux processus biologiques comme par exemple la phagocytose des bactéries et des virus par les cellules phagocytaires de l’organisme (macrophage) pour combattre les infections. Dans certaines situations ces radicaux libres augmentent fortement entrainant un stress oxydatif (Gutteridge, 1993).

Ce dernier n’est rien d’autre qu’un déséquilibre profond de la balance entre les pro-oxydants et les antioxydants (Pincemail et al., 1999) en faveur des premiers (pro-oxydants) et impliquant la production d’espèces réactives de l’oxygène (Pelletier et al., 2004). Cette production incontrôlée d’espèces réactives de l’oxygène aura la conséquence souvent lourde pour l’organisme. Toute formation d’espèces réactives n’est pas toujours synonymes de toxicité. En effet, certains radicaux libres sont des intermédiaires des processus physiologiques normales. Ce n’est que lorsque les systèmes de défenses sont dépassés et ne suffisent plus à neutraliser la surproduction de ces espèces que la toxicité apparait.

Toxicité des radicaux libres

Les effets destructeurs des radicaux libres au niveau cellulaire s’expliquent par la présence d’électron (s) très réactif (s) sur une de leurs orbitales, susceptible (s) de s’apparier aux électrons des composés environnants. Ces composés, ainsi spoliés, deviennent à leur tour des radicaux et amorcent une réaction en chaîne. Les molécules cibles sont :

Les protéines,

Les acides nucléiques,

Les acides gras polyinsaturés, en particulier ceux des membranes cellulaires et des lipoprotéines (Logani et Davies, 1980).

Action sur les protéines

Les protéines cellulaires sont une cible idéale de l’attaque radicalaire qui se situe à différent niveaux.

Les groupements sulfhydriles, présents dans de nombreuses enzymes, subissent sous l’action des RL, une déshydrogénation avec création de ponts disulfures et inactivation de ces enzymes (Logani et Davies, 1980).

On peut aussi rencontrer des cas d’activation enzymatique, lors de l’inactivation d’un inhibiteur spécifique.

Les protéines de structure sont dépolymérisées (acide hyaluronique) sous l’action des RL ou polymérisées de façon anarchique. Ainsi, le collagène est dégradé avec malformation des fibres et fragilisation des vaisseaux sanguins (Halliwell et Gutteridge, 1989).

Les acides aminés peuvent être modifiés. Par exemple, l’action de l’oxygène singulet sur la méthionine donne la méthionine sulfoxyde (Halliwell et Gutteridge, 1989).

Le radical hydroxyde réagit avec la phénylamine (PHE) et donne l’orthotyrosine (o-TYR) ou la para-tyrosine (p-TYR).

Action sur les acides nucléiques

Les acides nucléiques sont particulièrement sensibles à l’action des RL qui créent des sites radicalaires au sein de la molécule et peuvent ainsi induire des effets mutagènes ou l’arrêt des réplications ionisantes est, entre autres, due à l’action des radicaux libres au niveau de l’ADN cellulaire.

Outre cette action directe sur l’ADN, les radicaux libres altèrent la synthèse et la transcription de l’ARN.

Cette attaque provoque une baisse de concentration intracellulaire de la coenzyme NAD+, secondaire à son clivage par l’enzyme poly (ADP-ribose) synthétase, avec transfert de l’ADP- ribose sur la protéine nucléaire (Hoff et O’Neill, 1991).

Action sur les lipides

Cette action se fait au niveau des acides gras polyinsaturés des phospholipides et détermine la lipoperoxydation des membranes et des lipoprotéines, en particulier les lipoprotéines de faible densité (LDL).

Les principales espèces réactives sont consignées dans le tableau III avec leur formule chimique.

L’organisme se défend contre ces radicaux libres en produisant des enzymes qui les neutralisent : le superoxyde dismutase, le glutathion peroxydase, la catalase et aussi des molécules de faible masse moléculaire comme le tripeptide glutathion ou l’acide urique (Michiels et al., 1994).

Les antioxydants et système de protection contre les radicaux libres

L’oxydation est la portion d’une réaction d’oxydoréduction qui se caractérise par une perte d’électrons ou par l’augmentation algébrique du nombre d’électrons dans l’élément oxydé. En d’autres termes, l’oxydation est perceptible sous forme de rouille de Fer, de humaine des graisses et huiles et même de vieillissement pouvant toutefois entrainer l’apparition de maladies dégénératives (Harman, 1992).

Les antioxydants quant à eux se définissent comme étant des produits chimiques qui, plus spécifiquement retardent la détérioration, la rancidité ou la décoloration causée par l’oxydation. L’homme est un être aérobie et sa survie dans un environnement riche en oxygène dépend de l’équilibre vital entre la production physiologique de RL, et la capacité de l’organisme à les éliminer.

Toute surproduction de RL entraîne des désordres biologiques qui sont à l’origine de nombreuses pathologies. C’est ainsi que l’organisme dispose de différents systèmes de protection :

-Des systèmes de protection endogènes comprenant de systèmes enzymatiques et non enzymatiques.

-Des systèmes de protection exogènes.

Les moyens de défense endogènes

Les systèmes enzymatiques :

Ils comprennent les superoxydes dismutase (SOD), la catalase, la glutathion peroxydase, pour l’essentiel.

Les superoxydes dismutase (SOD) :

Ce sont des métalloprotéines qui accélèrent 109 fois la vitesse spontanée de dismutation de l’anion superoxyde en eau oxygénée et en oxygène moléculaire, la réaction est la suivante : O2●- + O2●- + 2H+ H2O + 3/2 O2

La catalase

Son action complète celle des SOD, en accélérant la réduction spontanée de la peroxydase d’hydrogène en eau : 2H2O2 2H2O + O2 La glutathion peroxydase

C’est une enzyme séléno dépendante, localisée dans le cytoplasme cellulaire et retrouvée au niveau du foie, des cellules sanguines, des reins et du cristallin. Elle attaque, non seulement le peroxyde d’hydrogène mais également les hydro peroxydes d’acides gras avec comme donneur d’hydrogène le glutathion réduit. Ce dernier est régénéré à partir du glutathion oxydé grâce au NADPH, fourni par la voie des pentoses phosphates.

Les systèmes non enzymatiques

Ces systèmes agissent en complexant les métaux de transition comme le Fer et le Cuivre qui jouent un rôle important dans la lipoperoxydation ou bien se comportent en piégeurs de radicaux libres.

La transferrine ou sidérophiline et la lactoferrine :

Elles exercent leurs effets protecteurs en complexant le fer, l’empêchant ainsi de catalyser la formation du OH●.

La céruléoplasmine :

Elle agit en transportant le cuivre et en neutralisant l’anion superoxyde. Elle catalyse également l’oxydation du fer ferreux en fer ferrique sans libération de radicaux libres oxygénés intermédiaires.

L’albumine :

Elle se combine au cuivre et empêche la formation du radical hydroxyle (OH●). C’est également un puissant piégeur de l’acide hypochloreux (HClO), un oxydant produit par la myéloperoxydase au cours de la phagocytose.

L’haptoglobine et l’hémopexine :

Elles auraient des propriétés antioxydantes par fixation de l’hémoglobine et de l’hème qui sont porteuses de fer qu’ils peuvent libérer et donc initier des réactions telles que la lipoperoxydation.

L’acide urique :

Il inhibe la peroxydation lipidique en fixant le fer et le cuivre. C’est également un piégeur du radical peroxyde et de l’acide hypochloreux.

Le glucose et la bilirubine :

Le premier agit comme piégeur du radical hydroxyle et la seconde aurait une action protectrice par sa liaison avec l’albumine transporteuse d’acides gras libres.

Les moyens de défense exogènes

Ils sont constitués par toutes les substances d’origine alimentaire ou médicamenteuse capable d’inhiber l’action des radicaux libres.

La vitamine E ou alpha tocophérol :

Il existe quatre isomères α, β, γ, δ tocophérols dont α est le plus puissant. C’est un antioxydant qui, in vitro, va se localiser, grâce à sa lipophilie, dans les doubles couches lipidiques des membranes cellulaires, points stratégiques pour arrêter la lipoperoxydation.

La vitamine C ou acide ascorbique :

Elle possède la propriété de réagir avec l’ion peroxyde et le radical hydroxyle avec production d’un radical semi hydroascorbate. C’est également un piégeur de l’oxygène singulet et de l’acide hypochloreux.

La vitamine A :

Elle a une action antioxydante moins démontrée. Elle agirait sur l’oxygène singlet en le bloquant.

Les polyphénols :

Il existe de nombreux autres antioxydants. Parmi ces substances, certains sont regroupés dans le groupe des polyphénols, composés principalement de trois familles : les tanins, les flavonoïdes, les anthocyanes. Bien que non essesstielles, ces substances jouent pourtant le rôle majeur dans la lutte contre le stress oxydant.

Méthode de FRAP (Ferrric Reducing Antioxidant Power)

L’activité réductrice du fer de nos extraits est déterminée par la méthode décrite par (Bassene 2012), basée sur la réaction chimique de réduction du Fe3+ présent dans le complexe K3Fe(CN) 6 en Fe 2+.
Principe
En présence d’une substance capable de céder des électrons, le Fe3+ présent dans K3Fe(CN)6 est réduit en Fe2+. La réduction est révélée par le virement de la coloration jaune du fer ferrique (Fe3+) en couleur bleu vert du fer ferreux (Fe2+) L’absorbance du milieu réactionnel est déterminée à 700 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. L’intensité de la couleur bleu est proportionnelle à la capacité de l’extrait utilisé.

Méthode de fixation du radical nitro-oxyde (no.)

Le protocole utilisé est celui décrit par (Garat, 1964). En milieu aqueux, aérobie et en présence de lumière, le Nitroprussiate (Fe(CN)5NO) libère le monoxyde d’azote (NO) qui va se convertir en dioxyde d’azote (NO2). En milieu acide, le dioxyde d’azote produit peut se fixer sur l’acide sulfanilique ou acide 4-aminobenzenesulfonique (C6H7NO3S) pour former un sel de diazonium. Dans les mêmes conditions, ce sel de diazonium peut se complexer à une molécule de N-(1Naphtyl) ethylène diamine (C12H14N2) pour former un complexe azo coloré qui absorbe à 540 nm et dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de dioxyde d’azote initialement présent dans le milieu.

Test TEAC (Trolox Equivalent Antioxydant Capacity)

Trolox Equivalent Antioxydant Capacity ou test ABTS+ Decolorization Assay. Ce test est basé sur la capacité d’un antioxydant à stabiliser le radical cationique ABTS+ de coloration bleu-verte en le transformant en ABTS+ incolore, par piégeage d’un proton par l’antioxydant. Une comparaison est faite avec la capacité du Trolox (analogue structural hydrosoluble de la vitamine E) à capturer le radical ABTS+.
La décroissance de l’absorbance causée par l’antioxydant reflète la capacité de capture du radical libre. La capacité antioxydante, exprimée en équivalent Trolox (TEAC) correspond donc à la concentration de Trolox ayant la même activité que la substance à tester à une concentration. Le résultat est donné en µM ou mM d’équivalent Trolox par g de produit ou par ml s’il s’agit d’un liquide. La méthode a été standardisée, avec un temps fixe d’incubation qui peut dans certains cas, engendrer une sous-estimation de la valeur obtenue. On parle alors de capacité antioxydante relative. Dans ce cas, on peut envisager de laisser se dérouler la réaction jusqu’au bout et recalculer la valeur TEAC (Rice-Evans et al., 1995).

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Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTE : RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE I : RAPPELS SUR Xylopia aethiopica (A.Rich)
I.1 Systématique
I.2 Description botanique
I.2.1 Nom locaux et synonymes
I.2.1.1 Noms locaux
I.2.1.2 Synonymes
I.2.2 Description de l’espèce
I.3 Répartition géographique et habitat
I.4 Travaux effectués sur la plante
I.4.1 Chimie
I.4.2 Pharmacologie
I.4.2.1 Activité antibactérienne
I.4.2.2 Usages empiriques
CHAPITRE II : RAPPELS SUR LES RADICAUX LIBRES ET LES ANTIOXYDANTS
II.1 Généralités sur les radicaux libres et le stress oxydatif
II.2 Toxicité des radicaux libres
II.2.1 Action sur les protéines
II.2.2 Action sur les acides nucléiques
II.2.3 Action sur les lipides
II.3 Les antioxydants et système de protection contre les radicaux libres
II.3.1 Les moyens de défense endogènes
II.3.1.1 Les systèmes enzymatiques :
II.3.1.2 Les systèmes non enzymatiques
II.3.2 Les moyens de défense exogènes
CHAPITRE III : LES METHODES D’ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE
III.1 Méthode de DPPH. (1,1-Diphényl-2-Plicryl-Hydrazy)
III.2 Méthode de FRAP (Ferrric Reducing Antioxidant Power)
III.3 Méthode de fixation du radical nitro-oxyde (no.)
III.4 Test TEAC (Trolox Equivalent Antioxydant Capacity)
DEUXIEME PARTIE :ETUDE EXPERIMENTALE
CHAPITRE I : MATERIEL ET METHODES
I.1 Matériel et réactifs
I.1.1 Matériel
I.1.1.1 Matériel végétal
I.1.1.2 Matériel de laboratoire
I.1.2 Principaux réactifs utilisés
I.2 Méthode D’étude
I.2.1 Obtention des extraits
I.2.2 Caractérisation
I.2.2.1 Recherche des alcaloïdes
I-2-2-2 Recherche des hétérosides cardiotoniques
I-2-2-3 Recherche des tanins
I-2-2-4 Recherche des hétérosides flavoniques
I-2-2-5 Recherche des saponosides
I.2.3 Activité antioxydante
I.2.3.1 Test de piégeage du radical DPPH.
I.2.3.2 Test de la réduction du Fer FRAP
I.3 Expressions des résultats
I.3.1 Méthode de DPPH.
I.3.2 Méthode de FRAP
I.3.3 Analyses statistiques
CHAPITRE II : RESULTATS ET DISCUSSION
II.1 Résultats
II.1.1 Extraction
II.1.2 Caractérisation
II.1.3 Activité antioxydante
II.1.3.1 Méthode de DPPH.
II.1.3.1.1 Extrait aqueux des fruits du Xylopia aethiopica
II.1.3.1.2 Huile extraite des fruits du Xylopia aethiopica
II.1.3.1.3 Action de l’acide ascorbique sur le DPPH.
II.1.3.2 Méthode de FRAP
II.1.3.2.1 Extrait aqueux des fruits du Xylopia aethiopica
II.1.3.2.2 Huile extraite des fruits du Xylopia aethiopica
II.1.3.2.3 Action de la vitamine C
II.2 DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES