Aeromonas : Bactéries en forme de bacilles, extrémités arrondies, Gram négatif (Hochedez et al. 2009). Ce sont des aéro-anaérobies facultatifs, positifs au test à l’oxydase (Abbot et al. 2003 ; Harf-Monteil et Monteil, 2007 ; Bin Kimgombe et al. 2004 ; Laganowska et Kaznowski, 2004 ; Recule et Hirtz, 1994) et parfois mobiles (Laganowska et Kaznowski, 2004). Les premières souches d’Aeromonas ont été isolées en 1890 par Sanarelli (Harf-Monteil et Monteil, 2007). Depuis, le genre Aeromonas appartient à la famille des Aeromonadacae de la classe des γprotéobactéries (Harf-Monteil et Monteil, 2007). Le genre d’Aeromonas comprend 17 espèces réparties en 20 groupes d’hybridations (Casco’n et al. 2000 ; Harf Monteil et Monteil, 2007 ; Harf-Monteil et al. 2004 ; Minana-Galbis et al. 2007). Au cours de ces dernières années, beaucoup de scientifiques orientent leurs recherchent en ce sens. Les espèces d’Aeromonas sont largement distribuées dans les environnements aquatiques et terrestres (Abbey et Etang, 1988 ; Abbey et Etang, 1991 ; Nam et Joh, 2007 ; Minana-Galbis et al. 2007). Les Aeromonas prolifèrent dans l’eau douce (Wu et al. 2007), les eaux usées (Shannon et al. 2007 ; Sechi et al. 2002), les eaux marines et l’eau potable (Sechi et al. 2002), ainsi que dans les sols (Wu et al. 2007). Ce genre de bactéries peut être également détecté dans différents aliments dont principalement les crustacés, les poissons, les viandes, le lait cru et les crudités (Clity et al. 2003).
Certaines espèces du genre Aeromonas sont des agents pathogènes des poissons (Yogananth et al. 2009) notamment Aeromonas salmonicida qui peut parfois être la cause des furonculoses chez cette espèce animale. Elles sont aussi des agents pathogènes des animaux poïkilotermes tels que les reptiles et les amphibiens (Abbey et Etang, 1988 ; Abbey et Etang, 1991 ; Krovacek et al. 1994). Certaines d’autres sont des pathogènes stricts ou des pathogènes opportunistes chez l’homme (Tena et al. 2009 ; Laganowska et Kaznowski, 2004 ; Nam et Joh, 2007 ; Sechi et al. 2002 ; Shannon et al. 2007 ; Minana-Galbis et al. 2007). Chez l’homme, certaines espèces d’Aeromonas sont responsables de différentes maladies et infections. Ces espèces sont Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, Aeromonas veronii bv sobria, Aeromonas veronii bv veronii Aeromonas jandaei et Aeromonas shubertii (Harf Monteil et Monteil, 2007). Toutefois, les trois principales espèces d’intérêt clinique demeurent A. hydrophila, A. caviae et A. veronii bv sobria qui sont responsables de plus de 85% des Aeromonoses (Harf-Monteil et Monteil, 2007 ; Janda, 1991 ; Janda et Abbott, 1998), elles causent principalement des gastroentérites et des infections cutanées (Tena et al. 2009 ; Janda et Abbott, 1998 ; Sinha et al. 2004), des infections des tissus mous (Hochedez et al. 2009 ; Bin Kimgombe et al. 2004 ; Laganowska et Kaznowski, 2004 ; Wu et al. 2007), des infections hépatobiliaires (Laganowska et Kaznowski, 2004 ; Wu et al. 2007) et plus rarement des bactériémies et des méningites surtout chez les immunodéprimés (Hochedez et al. 2009 ; Janda et Abbott, 1998).
Au cours de ces dernières années et en raison de leur rôle non négligeable dans les infections chez l’homme et les animaux (Hochedez et al. 2009 ; Wu et al. 2007 ; Janda, 1991), les espèces d’Aeromonas et particulièrement celles qui sont pathogènes ont suscité un intérêt croissant. Cependant, leur rôle n’est pas toujours clair, compte tenu de la complexité de leur taxonomie et du rôle encore incertain de leurs facteurs de virulence potentiellement associés aux infections humaines et animales. En effet, la taxonomie du genre Aeromonas a été fréquemment soumise à des changements du fait de la description de nouvelles espèces nouvellement décrites (Küpfer et al. 2006). Les facteurs de virulence essentiellement étudiés chez les Aeromonas et plus particulièrement A. hydrophila, A. caviae et A. veronii bv sobria sont (i) deux entérotoxines cytotoniques ; l’une thermostable codée par le gène ast, l’autre thermolabile codée par le gène alt, (ii) des entérotoxines cytotoxiques codées par les gènes AHCYTOEN et (iii) deux hémolysines ; l’aérolysine codée par le gène aerA et l’hémolysine codée par le gène hlyA (Wu et al. 2007). D’après certaines études, la présence de ces facteurs de virulence majeurs chez certaines espèces d’Aeromonas n’a pas été toujours corrélée aux infections cliniques, telles que les infections invasives ou la bactériémie (Wu et al. 2007 ; Yu et al. 2004). Cependant, certaines d’autres (Tena et al. 2009) trouvent que les aeromonoses sont des infections nosocomiales dans la ma jorité des cas des patients de leurs études. Tandis que d’autres études (Yogananth et al. 2009) montrent une forte relation entre la présence de ces facteurs de virulence et la pathogénicité des Aeromonas qui les contiennent.
L’intérêt de la partie bibliographique du présent mémoire est d’établir un bilan des connaissances et des limites de la taxonomie des espèces du genre Aeromonas ainsi que l’état de la description des facteurs de virulence des Aeromonas associés aux espèces cliniquement importantes. Partant de ce constat, l’objectif de notre travail est de déterminer le danger associé aux espèces d’Aeromonas, en recherchant la présence des principaux gènes de virulence. Au total, 159 souches d’origines clinique et environnementale ont été collectées. Leur identification a été effectuée sur des bases biochimiques grâce à la galerie api20E (BioMérieux, Marcy l’étoile, France) et le système Omnilog ID (BIOLOG, Hayward CA, U.S.A) ainsi qu’une identification génotypique basée sur le séquençage de gène rpoB. La détection des gènes de vi rulence chez ces souches a été réalisée par PCR.
Taxonomie
Taxonomie « polyphasique » : méthode très utilisée actuellement vue qu’elle prend en compte le maximum de techniques possibles pour obtenir une résolution fine des différents groupes bactériens. Cette taxonomie a à la fois le phénotype et les informations génomiques.
Identifications phénotypiques
Selon un article assez récent de Renaud F (Renaud et Aubel, 2007), l’historique de la taxonomie était clairement décrit : En 1923 est paru le premier ouvrage « moderne » de classification, avec le Bergey’s Manual of determinative bacteriology. Ensuite, dans les années 1950, est née la taxonomie numérique qui permettait la manipulation de grandes tables numériques correspondant à des caractères physiologiques, biochimiques ou autres des bactéries. Le phénotype fait référence à la manière dont le génotype est exprimé.
L’identification phénotypique des Aeromonas est basée sur un nombre de tests biochimiques. Par exemple, dans le tableau 1, les trois espèces d’intérêt clinique: A. hydrophila, A. caviae, A. veronii biogroupe Sobria sont distinguées sur la base de 15 caractères biochimiques dont 4 sont invariablement positifs et 2 sont invariablement négatifs (ressemblance phénotypiques dans 40% des tests entre ces espèces). De même, les espèces A. veronii biogroupe Veronii et A. jandaei ont montré sur ces 15 caractères biochimiques, 6 positifs et 3 négatifs (représentant 60% de ressemblance phénotypi que).
L’identification de quelques espèces est problématique car la classification en groupes phénotypiques, sur la base de tests biochimiques conventionnels, diffère de celle obtenue en groupes génétiques (Janda et al. 1996). De plus, plus le nombre de tests biochimiques est augmenté, moins l’identification phénotypique et l’identification génomique sont corrélées (Abbot et al. 2003 ; Abbott et al. 1992 ; Altwegg et al. 1990; Janda et al. 1996). Par exemple Abbott et al. (Abbott et al. 2003) ont montré que sur 63 tests biochimiques, les trois espèces d’Aeromonas d’intérêt clinique (A. hydrophila, A. caviae et A. veronii biogroupe Sobria) sont invariablement positives sur 5 tests et invariablement négatifs sur 6 autres (17,46% de ressemblance). A l’heure actuelle, les caractères biochimiques utilisés seuls sont insuffisants pour distinguer les espèces d’Aeromonas entre elles. La méthode phénotypique apparaît ainsi connue une méthode d’identification et de classification insuffisante pour les espèces d’Aeromonas.
Identifications génotypiques
Les identifications génotypiques reposent sur l’information génétique contenue dans les séquences nucléotidiques. Le génotype est la partie de l’information génétique qui, intervenant avec le milieu extérieur, conduit au phénotype (Renaud et Aubel 2007). Les informations génomiques peuvent provenir de l’hybridation ADN/ADN, et des séquences des gènes conservés tels que l’ADNr16S, gyrB, rpoD, rpoB et récemment dnaJ. Les méthodes de biologie moléculaire ont changé la façon de classer les bactéries, et ce en analysant le plus grand nombre possible de leurs caractères génotypi ques.
L’hybridation ADN/ADN
L’hybridation ADN/ADN consiste à hybrider la totalité de deux génomes bactériens entre eux, permettant ainsi de mesurer une certaine similarité entre deux molécules d’ADN (Renaud et Aubel 2007). Le degré de relation entre deux souches est basé en premier sur le pourcentage d’hybridation et aussi sur la différence des températures de semi-dénaturation « ΔTm ». Une hybridation à 70% et un ΔTm de 4 – 5°C correspond à une identité de séquence de 96%. Actuellement, 17 espèces du genre Aeromonas sont classées en 20 groupes d’hybridation bien définis (Tableau2). Une autre espèce : Aeromonas bivalvium isolée des mollusques dans une étude de Minana-Galbis et al. (Minana-Galbis et al. 2007) n’est toujours pas classée dans ce tableau en raison des recherches non terminée sur cette espèce pour pouvoir la classer soit indépendemment ou appar tenant à une classe d’espèces déjà prédéfinie et classée. Cependant, l’hybridation ADN/ADN est une méthode longue, fastidieuse, onéreuse et ne per mettant de compar er que deux ADN entr e eux à la fois.
Les gènes: 16S, gyrB, rpoD, rpoB, dnaJ
Les gènes de ménage constituent de bons marqueurs moléculaires dans l’étude des relations phylogénétiques et taxonomiques des espèces d’Aeromonas (Nováková et al. 2009, Küpfer et al. 2006).
Le gène de l’ADNr16S (1650 pb) est le plus souvent utilisé en taxonomie moléculaire. Ce gène est présent chez toutes les bactéries (universel). Toutes les molécules de ce gène ont la même structure secondaire ce qui fait que si des modifications de structure primaire se reproduisent, elles doivent toujours respecter les positions permettant les repliements (Renaud et Aubel, 2007). De plus, le nombre et la diversité considérables de séquences disponibles de ce gène dans les bases de données permettent des comparaisons rapides et efficaces. L’analyse du gène de l’ADNr16S a indiqué que le genre Aeromonas est composé d’un groupe d’espèces très proches génétiquement (98.7%) (Soler et al. 2004), les séquences déterminant certaines espèces ne différant que par quelques nucléotides (Küpfer et al. 2006). Les espèces les plus proches par taxonomie du gène de l’ADNr16S sont notamment A. schubertii et Aeromonas encheleia (Saavedra et al. 2006), ceci se confond avec les études réalisées par Martinez-Murcica et al. (Martinez-Murcica et al. 1999) ainsi que Küpfer et al. (Küpfer et al. 2006) .
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Table des matières
Introduction
Partie bibliographique
I. Taxonomie
II.1. Identifications phénotypiques
II.2. Identifications génotypiques
II.2.1. L’hybridation ADN/ADN
II.2.2. Les gènes: 16S, gyrB, rpoB, rpoD, dnaJ
II. Facteurs de virulence
III.1. Facteurs d’adhérence
III.2. Pili
III.3. OMP et flagelles
III.4. Système de sécrétion de type III (TTSS)
III.5. Les hémolysines
III.6. Les entérotoxines
III.7. Les enzymes extracelleulaires
III.7.1. Les protéases
III.7.2. Les lipases
Partie expérimentale
I. Matériel et métodes
I.1. Collection des souches, culture, et conservation
I.1.1. Souches d’origine clinique
I.1.2. Souches d’origine environnementale
I.2. Identification des souches
I.2.1. Identification par la galerie Api20E
I.2.2. Identification des souches par Omnilog ID
I.2.3. Identification par le séquençage du gène rpoB
I.3. Extraction d’ADN génomique
I.4. Détection des gènes de virulence par PCR
I.4.1. PCR et choix des amorces
I.4.2. Conditions de PCR
I.4.3. Confirmation par le séquençage
II. Résultats
II.1. Identification par galerie Api20E
II.2. Identification par Omnilog ID
II.3. Identification par le séquençage du gène rpoB
II.4. Comparaison: séquençage du gène rpoB-galerie Api20EOmnilogID
II.5. Détection des gènes de virulence
II.5.1. Souches cliniques
II.5.2. Souches environnementales
III. Discussions
III.1. Souches cliniques
III.2. Souches environnementales
III.3. Comparaison Omnilog ID– séquençage rpoB
III.4. Comparaison Omnilog ID – galerie Api20E
III.5. Détection des gènes de virulence
IV. Conclusion
V. Références bibliographiques
VI. Annexes
